Præsenteret her er en protokol for adskillelse af epidermis fra dermis at evaluere inflammatoriske mægler produktion. Efter betændelse adskilles rotte hindpote epidermis fra dermis ved termolysin ved 4 °C. Epidermis bruges derefter til mRNA-analyse af RT-PCR og proteinevaluering af vestlig blot og immunohistochemistry.
Brugervenlige og billige teknikker er nødvendige for at bestemme den stedsspecifikke produktion af inflammatoriske mæglere og neurotrophins under hudskade, betændelse og / eller sensibilisering. Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en epidermal-dermal separationsprotokol ved hjælp af termolysin, en proteinase, der er aktiv ved 4 °C. For at illustrere denne procedure bedøves Sprague Dawley-rotter, og højre bagpote injiceres med carrageenan. Seks og tolv timer efter injektionen aflives rotter med betændelse og naive rotter, og et stykke bagpote, glabrous hud placeres i kold Dulbeccos Modificerede Eagle Medium. Epidermis adskilles derefter ved kældermembranen fra dermis ved termolysin i PBS med calciumchlorid. Dernæst er dermis sikret af mikrodissection pincet, og epidermis er forsigtigt drillet væk. Toluidinblå farvning af vævssektioner viser, at epidermis adskilles rent fra dermis i kældermembranen. Alle keratinocytcellelag forbliver intakte, og de epidermale rete-højderygge sammen med fordybninger fra dermal papillae observeres tydeligt. Kvalitativ og real-time RT-PCR bruges til at bestemme nerve vækstfaktor og interleukin-6 udtryk niveauer. Vestlige blotting og immunohistochemistry er endelig udført for at opdage mængder af nerve vækstfaktor. Denne rapport illustrerer, at kold termolysin fordøjelsen er en effektiv metode til at adskille epidermis fra dermis til vurdering af mRNA og protein ændringer under inflammation.
Evaluering af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer fra huden kan begrænses på grund af heterogeniteten af celletyper, der findes i den betændte dermis og epidermis1,2,3. Flere enzymer, kemiske, termiske eller mekaniske teknikker, der involverer adskillelse af de to lag eller til udførelse af celleafkobling til evaluering, er for nylig blevet gennemgået4. Syre, alkali, neutralt salt og varme kan opdele epidermis fra dermis hurtigt, men cellulær og ekstracellulær hævelse forekommer ofte5,6. Trypsin, pancreatin, elastase, keratinase, collagenase, pronase, dispase og termolysin er enzymer, der er blevet brugt til epidermal-dermal separation4,7. Trypsin og andre proteolytiske enzymer i bred skala er aktive ved 37-40 °C, men skal overvåges nøje for at forhindre dissociation af epidermale lag. Dispase kløver epidermis på lamina densa, men kræver 24 timer for adskillelse i kulden4,8 eller kortere tidspunkter ved 37 °C4,9. Et begrænsende træk ved alle disse teknikker er den potentielle forstyrrelse af vævsmorfologi og tab af integritet af mRNA og protein.
For at opretholde integriteten af mRNA og protein skal der udføres en hudadskillelsesmetode i kulden i en kort periode. Ved evaluering af hudsepareringsteknikker til betændelsesundersøgelser er termolysin et effektivt enzym til at adskille epidermis fra dermis ved kolde temperaturer4. Termolysin er aktiv ved 4 °C, kløver epidermale hemidesmosomer fra lamina lucida og adskiller epidermis fra dermis inden for 1-3 h4,8,10. Målet med denne rapport er at optimere brugen af termolysin til adskillelse af betændt rotte epidermis fra dermis til at opdage mRNA og proteinniveauer for inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer. Flere foreløbige rapporter er blevet præsenteret11,12,13,14,15. Formålet med dette manuskript er at beskrive en optimal hudadskillelsesteknik ved hjælp af termolysin og demonstrere påvisning af 1) markører for inflammation, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA og 3) nervevækstfaktor (NGF) mRNA og protein i epidermis af rotter med carrageenan-induceret inflammation (C-II)16,17. En foreløbig rapport ved hjælp af den komplette Freunds adjuvansmodel indikerer, at NGF mRNA og proteinniveauer stiger tidligt underinflammation 15. Hos mus forårsager hud sensibilisering med den aktuelle anvendelse af oxazolone en tidlig stigning i IL-6 mRNA ved hjælp af in situ hybridisering36. Både IL-6 og NGF har været impliceret i C-II18,19, men der har ikke været nogen rapporter, der beskriver mRNA eller proteinniveauer for IL-6 eller NGF specifikt fra epidermis i de akutte stadier af C-II.
Termolysinteknikken er billig og ligetil at udføre. Desuden giver termolysinadskillelse af epidermis fra dermis mulighed for mRNA, vestlig blot og immunohistokemisk analyse af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer under betændelsesprocessen15. Efterforskere bør være i stand til nemt at bruge denne teknik i både prækliniske og kliniske undersøgelser af hudbetændelse.
Undersøgelsen fastslog, at epidermis af rotte bagpote glabrous hud let blev adskilt fra dermis ved hjælp af termolysin (0,5 mG/mL) i PBS med 1 mM calciumchlorid ved 4 °C i 2,5 timer. Histologiske evaluering viste, at epidermis var adskilt fra dermis i kælderen membranen, og at den epidermale rete kamme var intakte. Thermolysin er en ekstracellulær metalloendopeptidase produceret af Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Dens aktivitet er stabil ved 4 °C , men er…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen af denne forskning blev ydet af National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |