JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

Published: September 29, 2021
doi:
10.3791/59708
, , , , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics,Washington State University

Summary

Burada sunulan, enflamatuar mediatör üretimini değerlendirmek için epidermisin dermisten ayrılması için bir protokoldür. İltihaplanmadan sonra, sıçan arka pençe epidermisi 4 ° C’de termolysin ile dermisten ayrılır. Epidermis daha sonra RT-PCR ile mRNA analizi ve batı blot ve immünostokimyası tarafından protein değerlendirmesi için kullanılır.

Abstract

Cilt hasarı, iltihaplanma ve/veya duyarlılık sırasında enflamatuar mediatörlerin ve nörotrofinlerin bölgeye özgü üretimini belirlemek için kullanımı kolay ve ucuz tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmanın amacı, 4 °C’de aktif olan bir proteinaz olan termolysin kullanılarak epidermal-dermal ayırma protokolünü tanımlamaktır. Bu prosedürü göstermek için, Sprague Dawley sıçanları uyuşturulur ve sağ arka pençelere karragenan enjekte edilir. Enjeksiyondan altı ve on iki saat sonra, iltihaplı ve naif sıçanlara sahip sıçanlar ötenaziye tabir edilir ve soğuk Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortamı’na bir parça arka pençe, glabrous derisi yerleştirilir. Epidermis daha sonra bodrum zarında pbs’de termolysin ile dermisten kalsiyum klorür ile ayrılır. Daha sonra, dermis mikrodiseksiyon tokmaları ile sabitlendirilir ve epidermis hafifçe alay edilir. Doku bölümlerinin toluidin mavisi lekesi, epidermisin bodrum zarındaki dermisten temiz bir şekilde ayrıldığını göstermektedir. Tüm keratinosit hücre katmanları bozulmadan kalır ve epidermal rete sırtları ve dermal papilladan girintiler açıkça gözlenir. Sinir büyüme faktörünü ve interlökin-6 ekspresyon düzeylerini belirlemek için nitel ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanılır. Batı şişkinliği ve immünostokimya nihayet sinir büyüme faktörü miktarlarını tespit etmek için gerçekleştirilir. Bu rapor, soğuk termolysin sindiriminin, iltihaplanma sırasında mRNA ve protein değişikliklerinin değerlendirilmesi için epidermisi dermisten ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Introduction

İltihaplı dermis ve epidermis 1,2,3’tebulunan hücre tiplerinin heterojenliği nedeniyleinflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin deriden değerlendirilmesi sınırlanabilir. İki katmanın ayrılmasını veya değerlendirme için hücre ayrıştırmasını içeren çeşitli enzimler, kimyasal, termal veya mekanik teknikler yakın zamanda gözden geçirilmiştir4. Asit, alkali, nötr tuz ve ısı epidermisi dermisten hızlı bir şekilde ayırabilir, ancak hücresel ve hücre dışı şişlik genellikle5,6. Tripsin, pankreas, elastaz, keratinaz, kollajenaz, pronaz, dispaz ve termolysin epidermal-dermal ayırma için kullanılan enzimlerdir4,7. Tripsin ve diğer geniş ölçekli proteolitik enzimler 37-40 °C’de aktiftir, ancak epidermal tabakaların ayrışmasını önlemek için dikkatlice izlenmelidir. Dispaz epidermisi lamina densa’da ayırır, ancak soğukta ayırma için 24 saat gerektirir4,8 veya daha kısa zaman noktalarında 37 °C4,9. Tüm bu tekniklerin sınırlayıcı bir özelliği, doku morfolojisinin potansiyel bozulması ve mRNA ve proteinin bütünlüğünü kaybetmesidir.

mRNA ve protein bütünlüğünü korumak için soğukta kısa bir süre cilt ayırma yöntemi yapılmalıdır. İltihaplanma çalışmaları için cilt ayırma tekniklerinin değerlendirilmesinde, termolisin epidermisi soğuk sıcaklıklarda dermisten ayırmak için etkili bir enzimdir4. Thermolysin 4 °C’de aktiftir, epidermal hemidezmosomes’ı lamina lucida’dan ayırır ve epidermisi 1–3 h 4,8,10içinde dermisten ayırır. Bu raporun amacı, iltihaplı mediatörler ve nörotrofik faktörler için mRNA ve protein seviyelerini tespit etmek için iltihaplı sıçan epidermisinin dermisten ayrılması için termolizin kullanımını optimize etmektir. Çeşitli ön raporlar11 , 12,13,14,15. Bu makalenin amacı termolisin kullanarak optimal bir cilt ayırma tekniğini tanımlamak ve 1) inflamasyon belirteçlerinin, 2) interlökin-6 (IL-6) mRNA’nın ve 3) karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II)16,17olan sıçanların epiderminde sinir büyüme faktörü (NGF) mRNA ve proteinin tespitini göstermektir. Freund’un adjuvan modelinin tamamını kullanan bir ön rapor, NGF mRNA ve protein seviyelerinin iltihaplanma sırasında erken arttığını gösterir15. Farelerde, oksazolonun topikal uygulaması ile cilt duyarlılığı, in situ hibridizasyon36kullanarak IL-6 mRNA’da erken bir artışa neden olur. Hem IL-6 hem de NGF, C-II18,19‘akarışmıştır,ancak C-II’nin akut aşamalarında özellikle epidermisin epidermisinden IL-6 veya NGF için mRNA veya protein seviyelerini açıklayan hiçbir rapor olmamıştır.

Termolysin tekniği ucuz ve basittir. Ayrıca, epidermisin dermisten termoliz ayrılması, iltihaplanma sürecinde mRNA, batı lekesi ve inflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin immünohistokimyasal analizine izin verir15. Araştırmacılar bu tekniği cilt iltihabının hem klinik öncesi hem de klinik çalışmalarında kolayca kullanabilmelidir.

Protocol

Bu protokol Oklahoma Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi IACUC’nin (#2016-03) hayvan bakım yönergelerini takip etmektedir. 1. Karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II) Erkek ve/veya dişi Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g; 8-9 haftalık) izofluran (veya enjekte edilebilir anestezi) ile uyuşturmak. Korneaya dokunarak ve sol arka pençeyi hafifçe kıstırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvan uygun şekilde uyuşturuldığında, kornea veya pe…

Representative Results

Sıçan arka pençesine karragenan enjeksiyonu kızarıklık ve ödem gibi klasik iltihap belirtilerine neden oldu16,17. Arka pençenin şişmesi mekanik kaliperlerle ölçüldü20. Karragenan işlemden önce her sıçan için pençe kalınlığının temel değeri elde edildi ve tekrar 6 saat ve 12 saat olarak ölçüldü. Pençe kalınlığı taban çizgisi değerlerine göre önemli ölçüde arttırılmıştır (Ş…

Discussion

Çalışma, sıçan arka pençesi glabrous derisinin epiderminin PBS’de termolysin (0,5 mG/mL) kullanılarak dermisten 2,5 saat boyunca 4 °C’de 1 mM kalsiyum klorür ile kolayca ayrıldığını belirledi. Histolojik değerlendirmede epidermisin bodrum zarındaki dermisin arasından ayrıldığı ve epidermal rete sırtlarının sağlam olduğu belirtilmiştir. Thermolysin, Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24tarafından üretilen hücre dışı bir metalloendopepti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma için fon Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH-AR047410 (KEM) tarafından sağlanmıştır.

Materials

λ-carrageenan Millipore Sigma 22049 Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107 For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous Millipore Sigma 499609 Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium Millipore Sigma C0612 Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-31570 Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11966-025 To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid Millipore Sigma E6758 Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase Promega M1701 For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12) Santa Cruz Biotechnology sc-365944 For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5 Cedarlane Labs CL7756AP For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat Charles River Strain Code 400 Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix Thermo Fisher Scientific 1310TS Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix Thermo Fisher Scientific 4472908 For RT-PCR analysis
Thermolysin Millipore Sigma T7902 From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue Millipore Sigma 89640 For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 For total RNA extraction for RTPCR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
  4. Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
  5. Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
  6. Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
  7. Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
  8. Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
  9. Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
  10. Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
  11. Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
  12. Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
  13. Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
  14. Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  15. Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  16. Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
  17. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
  18. Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
  19. Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
  20. Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
  21. Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
  22. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
  23. Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
  24. van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
  25. Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
  26. Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
  27. Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
  28. Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  29. Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
  30. Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  31. Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
  32. Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
  33. Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
  34. Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
  35. Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
  36. Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
  37. Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).

Tags

EpidermisDermisThermolysinSkin InflammationInflammatory MediatorsNeurotrophinsWound HealingSkin DiseaseChronic WoundsBurnsEpithelial SurfacesGI TractCorneaSprague Dawley RatLambda CarrageenanEdemaGlabrous Hind PawMicrodissection ForcepsDMEMStratum Corneum
check_url/59708?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gujar, V., Anderson, M. B., Miller, K. E., Pande, R. D., Nawani, P., Das, S. Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein. J. Vis. Exp. (175), e59708, doi:10.3791/59708 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image