Separasjon av rotte epidermis og dermis med termolysin for å oppdage stedsspesifikk inflammatorisk mRNA og protein
Summary
Presentert her er en protokoll for separasjon av epidermis fra dermis for å evaluere inflammatorisk mediatorproduksjon. Etter betennelse er rotte bakpote epidermis skilt fra dermis ved termolysin ved 4 °C. Epidermis brukes deretter til mRNA-analyse av RT-PCR og proteinevaluering ved vestlig flekk og immunhiistokjemi.
Abstract
Brukervennlige og rimelige teknikker er nødvendig for å bestemme stedsspesifikk produksjon av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiner under hudskade, betennelse og / eller sensibilisering. Målet med denne studien er å beskrive en epidermal-dermal separasjonsprotokoll ved hjelp av termolysin, en proteinase som er aktiv ved 4 °C. For å illustrere denne prosedyren er Sprague Dawley rotter bedøvet, og høyre bakpoter injiseres med carrageenan. Seks og tolv timer etter injeksjon blir rotter med betennelse og naive rotter euthanized, og et stykke bakpote, glabrøs hud er plassert i kaldt Dulbeccos Modified Eagle Medium. Epidermis skilles deretter i kjellermembranen fra dermis ved termolysin i PBS med kalsiumklorid. Deretter er dermis sikret av mikrodesisseksjons tang, og epidermis er forsiktig ertet bort. Toluidinblå farging av vevsseksjoner viser at epidermis er skilt rent fra dermis i kjellermembranen. Alle keratinocyttcellelag forblir intakte, og de epidermale rete ryggene sammen med innrykk fra dermal papiller observeres tydelig. Kvalitativ og sanntids RT-PCR brukes til å bestemme nervevekstfaktor og interleukin-6 uttrykksnivåer. Vestlig blotting og immunhiistokjemi utføres endelig for å oppdage mengder av nervevekstfaktor. Denne rapporten illustrerer at kald termolysin fordøyelse er en effektiv metode for å skille epidermis fra dermis for evaluering av mRNA og protein endringer under betennelse.
Introduction
Evaluering av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer fra huden kan begrenses på grunn av heterogeniteten til celletyper som finnes i betent dermis og epidermis1,2,3. Flere enzymer, kjemiske, termiske eller mekaniske teknikker som involverer separasjon av de to lagene eller for å utføre celledissosiasjon for evaluering, har blitt gjennomgått nylig4. Syre, alkali, nøytralt salt og varme kan dele epidermis fra dermis raskt, men cellulær og ekstracellulær hevelse oppstår ofte5,6. Trypsin, pankreatin, elastase, keratinase, kollagenase, pronase, dispase og termolysin er enzymer som har blitt brukt til epidermal-dermal separasjon4,7. Trypsin og andre bredskala proteolytiske enzymer er aktive ved 37-40 °C, men må overvåkes nøye for å forhindre dissosiasjon av epidermale lag. Dispase cleaves epidermis på lamina densa, men krever 24 h for separasjon i kulde4,8 eller kortere tidspunkter ved 37 °C4,9. Et begrensende trekk ved alle disse teknikkene er potensiell forstyrrelse av vevsmorfologi og tap av integritet av mRNA og protein.
For å opprettholde integriteten til mRNA og protein, bør en hudseparasjonsmetode utføres i kulde i en kort periode. Ved evaluering av hudseparasjonsteknikker for betennelsesstudier er termolysin et effektivt enzym for å skille epidermis fra dermis ved kalde temperaturer4. Thermolysin er aktiv ved 4 °C, cleaves epidermale hemidesmosomer fra lamina lucida, og skiller epidermis fra dermis innen 1-3 h4,8,10. Målet med denne rapporten er å optimalisere bruken av termolysin for separasjon av betent rotte epidermis fra dermis for å oppdage mRNA og proteinnivåer for inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer. Flere foreløpige rapporter er presentert11,12,13,14,15. Målet med dette manuskriptet er å beskrive en optimal hudseparasjonsteknikk ved hjelp av termolysin og demonstrere påvisning av 1) betennelsesmarkører, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA, og 3) nervevekstfaktor (NGF) mRNA og protein i epidermis av rotter med carrageenan-indusert betennelse (C-II)16,17. En foreløpig rapport ved hjelp av den komplette Freunds adjuvansmodell indikerer at NGF mRNA og proteinnivåer øker tidlig under betennelse15. Hos mus forårsaker hudsensibilisering med aktuell påføring av oksazolon en tidlig økning i IL-6 mRNA ved hjelp av in situ hybridisering36. Både IL-6 og NGF har vært involvert i C-II18,19, men det har ikke vært noen rapporter som beskriver mRNA eller proteinnivåer for IL-6 eller NGF spesielt fra epidermis under de akutte stadiene av C-II.
Termolysinteknikken er billig og grei å utføre. Videre tillater termolysinseparasjon av epidermis fra dermis mRNA, vestlig blot og immunhiistokjemisk analyse av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer under prosessen med betennelse15. Etterforskere skal enkelt kunne bruke denne teknikken i både prekliniske og kliniske studier av hudbetennelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien fastslo at epidermis av rotte bakpote glabrøs hud lett ble skilt fra dermis ved hjelp av termolysin (0,5 mG / ml) i PBS med 1 mM kalsiumklorid ved 4 °C i 2,5 timer. Histologisk evaluering indikerte at epidermis ble skilt fra dermis ved kjellermembranen og at de epidermale rete ryggene var intakte. Thermolysin er en ekstracellulær metalloendopeptidase produsert av Gram-positiv (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Aktiviteten er stabil ved 4 °C, men fungerer over et bre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtten til denne forskningen ble gitt av National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
