Individuazione di prodotti naturali con filtraggio della frammentazione diagnostica LC-MS/MS: applicazione per l'analisi microcystin
Summary
Il filtraggio della frammentazione diagnostica, implementato in MZmine, è un approccio elegante e post-acquisizione per lo schermo di DataSet LC-MS/MS per intere classi di prodotti naturali conosciuti e sconosciuti. Questo strumento ricerca gli spettri MS/MS per gli ioni prodotto e/o le perdite neutre che l’analista ha definito come diagnostica per l’intera classe di composti.
Abstract
I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili, piuttosto che un singolo composto. A causa delle loro caratteristiche strutturali comuni, molti composti all’interno della stessa classe subiscono una simile frammentazione MS/MS e hanno diversi ioni di prodotto identici e/o perdite neutre. Lo scopo del filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF) è quello di rilevare in modo efficiente tutti i composti di una determinata classe in un estratto complesso, vagliando DataSet LC-MS/MS non mirati per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre. Questo metodo è basato su un modulo DFF implementato all’interno della piattaforma MZmine open-source che richiede estratti campione essere analizzati da acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione come quadrupolo Orbitrap o quadrupolo di massa di tempo di volo Analizzatori. La limitazione principale di questo approccio è l’analista deve prima definire quali ioni di prodotto e/o le perdite neutre sono specifici per la classe mirata di prodotti naturali. DFF consente la successiva scoperta di tutti i prodotti naturali correlati all’interno di un campione complesso, compresi i nuovi composti. In questo lavoro, dimostreremo l’efficacia del DFF mediante screening degli estratti di Microcystis aeruginosa, una prominente fioritura algale nociva che causa cianobatteri, per la produzione di microcistine.
Introduction
La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo di spettrometria di massa ampiamente utilizzato che comporta l’isolamento di uno ione precursore e l’induzione della frammentazione tramite l’applicazione di energia di attivazione come la dissociazione indotta da collisione (CID)1. Il modo in cui un frammento di ioni è intimamente legato alla sua struttura molecolare. I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili piuttosto che come un unico chimico unico2. In quanto tali, i composti strutturalmente correlati che fanno parte della stessa classe biosintetica condividono spesso caratteristiche chiave di frammentazione MS/MS, tra cui ioni di prodotti condivisi e/o perdite neutre. La capacità di schermo campioni complessi per composti che possiedono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre è una potente strategia per rilevare intere classi di composti, potenzialmente portando alla scoperta di nuovi prodotti naturali3, 4 , 5 il , 6. per decenni, metodi di spettrometria di massa come la scansione di perdita neutra e la scansione di ioni precursori eseguite su strumenti a bassa risoluzione hanno consentito agli ioni con la stessa perdita neutra o gli ioni di prodotto da rilevare. Tuttavia, gli ioni o le transizioni specifiche dovevano essere definite prima di eseguire gli esperimenti. Poiché gli spettrometri di massa ad alta risoluzione sono diventati più popolari nei laboratori di ricerca, i campioni complessi sono ora comunemente sottoposti a screening utilizzando metodi di acquisizione dipendenti dai dati non mirati (DDA). Contrariamente alla tradizionale perdita neutra e alla scansione a ioni precursori, i composti strutturalmente correlati possono essere identificati mediante l’analisi post-acquisizione7. In questo lavoro, si dimostra una strategia che abbiamo sviluppato definito filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF)5,6, un approccio semplice e facile da usare per rilevare intere classi di composti all’interno di matrici complesse. Questo modulo DFF è stato implementato nella piattaforma open-source MZmine 2 e disponibile scaricando MZmine 2,38 o versioni più recenti. DFF consente agli utenti di seriare in modo efficiente i DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotto e/o perdite neutre (es) che sono diagnostiche per intere classi di composti. Una limitazione della DFF è la caratteristica degli ioni di prodotto e/o le perdite neutre per una classe di composti devono essere definite dall’analista.
Ad esempio, ognuna delle più di 60 diverse micotossine fumonisine identificate8,9 possiedono una catena laterale tricarballilico, che genera una m/z 157,0142 (C6H5O5–) prodotto ione su frammentazione della [M-H]– Ion4. Pertanto, tutte le fumonisine putativo in un campione possono essere rilevate utilizzando DFF mediante lo screening di tutti gli spettri MS/MS all’interno di un DataSet DDA che contengono lo ione di prodotto m/z 157,0142 prominente. Analogamente, i composti Solfatati possono essere rilevati mediante screening dei DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono una perdita diagnostica neutra di 79,9574 da (SO3)3. Questo approccio è stato anche applicato con successo per la rilevazione di nuovi peptidi ciclici5 e prodotti naturali che contengono i residui di triptofano o fenilalanina6.
Per dimostrare l’efficacia del DFF e la sua facilità d’uso all’interno della piattaforma MZmine10, abbiamo applicato questo approccio all’analisi delle microcistine (MCS); una classe di oltre 240 tossine strutturalmente correlate prodotte da acqua dolce cianobatteri11,12,13.
Le cianotossine più comunemente segnalate sono MCs, con il congenitore MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) più frequentemente studiato (Figura 1). Gli MCs sono heptapeptides monociclici non ribosomiali, biosintetizzati da diversi generi di cianobatteri tra cui Microcystis, Anabaena, Nostoc e Planktothrix12,13. Gli MCs sono composti da cinque residui comuni e due posizioni variabili occupate da aminoacidi L. Quasi tutti i MCs possiedono un residuo di acido β-aminoacido 3-ammino-9-metossi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoico (Adda) alla posizione 511. I percorsi di frammentazione MS/MS di MCS sono ben descritti14,15; il residuo di Adda è responsabile della prominente ione MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+) e di altri ioni di prodotto tra cui m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (Figura 2). I DataSet DDA non mirati degli estratti cellulari Microcystis aeruginosa possono essere proiettati per tutte le microcistine presenti utilizzando questi ioni diagnostici, dato che le microcistine hanno un residuo di Adda.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF è una strategia diretta e rapida per la rilevazione di intere classi di composti, particolarmente rilevanti per la scoperta di composti naturali di prodotti. L’aspetto più importante della DFF è la definizione dei criteri specifici di frammentazione MS/MS per la classe mirata di composti. In questo esempio rappresentativo, DFF è stato utilizzato per rilevare tutti i residui di Adda contenenti MCs presenti in un estratto cellulare M. aeruginosa . Sebbene la stragrande maggioranza dei MCs contenga un resid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Heather Roshon (centro di cultura Phycologica canadese, Università di Waterloo per aver fornito la coltura di cianobatteri studiata e Sawsan Abusharkh (Carleton University) per l’assistenza tecnica.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
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