اكتشاف المنتجات الطبيعية مع تصفيه التجزئة التشخيصية LC-MS/MS: تطبيق لتحليل ميكروسيستن
Summary
تصفيه التجزئة التشخيصية ، التي تم تنفيذها في MZmine ، هو أسلوب أنيق ، بعد الاستحواذ علي شاشه بيانات LC-MS/MS لفئات كامله من المنتجات الطبيعية المعروفة وغير المعروفة. تقوم هذه الاداه بالبحث في أطياف MS/MS لأيونات المنتج و/أو الخسائر المحايدة التي عرفها المحلل علي انها تشخيص للفئة الكاملة من المركبات.
Abstract
وغالبا ما تكون المنتجات الطبيعية بيوسينثيسيزيد كخليط من مركبات مماثله هيكليا, بدلا من مركب واحد. نظرا لخصائصها الهيكلية المشتركة ، العديد من المركبات داخل نفس الفئة الخضوع لتجزئه MS/MS مماثله ولها عده أيونات المنتج متطابقة و/أو خسائر محايده. والغرض من تصفيه التجزئة التشخيصية هو الكشف بكفاءة عن جميع مركبات فئة معينه في مقتطف معقد عن طريق فحص مجموعات بيانات LC/ms/ms غير المستهدفة لأطياف MS/ms التي تحتوي علي أيونات منتجات محدده الفئة و/أو خسائر محايده. ويستند هذا الأسلوب علي وحده قوات الأمر التي تنفذ داخل منصة MZmine مفتوحة المصدر التي تتطلب مقتطفات عينه يتم تحليلها عن طريق الحصول علي البيانات التي تعتمد علي مطياف كتله عاليه الاستبانة مثل رباعي اورراب أو رباعي الوقت من الطيران الشامل تحليل. والقيد الرئيسي لهذا النهج هو ان المحلل يجب ان يحدد أولا أيونات المنتجات و/أو الخسائر المحايدة المحددة للفئة المستهدفة من المنتجات الطبيعية. وتسمح قوات التدخل الخاصة بالاكتشاف اللاحق لجميع المنتجات الطبيعية ذات الصلة داخل عينه معقده ، بما في ذلك المركبات الجديدة. في هذا العمل ، ونحن نظهر فعاليه قوات الأمر الذي من خلال فحص مقتطفات من الزنجاريه Microcystis ، وهو الطحالب الضارة البارزة التي تسبب البكتيريا الزرقاء ، لإنتاج ميكروكسينينس.
Introduction
والطيف الكتلي الترادفي (MS/MS) هو أسلوب طيفي للكتلة يستخدم علي نطاق واسع وينطوي علي عزل أيون السلائف والحث علي التجزؤ عن طريق استخدام طاقة التنشيط مثل التفكك المستحث بالاصطدام (CID)1. الطريقة التي تكون فيها شظايا الأيونات مرتبطة ارتباطا وثيقا ببنيتها الجزيئية. وغالبا ما تكون المنتجات الطبيعية بيوسينثيسيزيد كخليط من مركبات مماثله هيكليا بدلا من كماده كيميائية واحده فريدة من نوعها2. وعلي هذا النحو ، فان المركبات ذات الصلة الهيكلية التي تشكل جزءا من نفس الفئة الحيوية غالبا ما تشترك في خصائص تجزئه MS/MS الرئيسية ، بما في ذلك أيونات المنتجات المشتركة و/أو الخسائر المحايدة. القدرة علي فحص العينات المعقدة للمركبات التي تمتلك أيونات المنتجات الخاصة بالفئة و/أو الخسائر المحايدة هي استراتيجية قويه للكشف عن فئات كامله من المركبات ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف المنتجات الطبيعية الجديدة3، 4 , 5 , 6-وعلي مدي عقود ، سمحت أساليب قياس الطيف الكتلي مثل المسح المحايد للخسارة والفحص بالسلائف الايونيه باستخدام أدوات منخفضه الاستبانة بالكشف عن الأيونات التي لها نفس الخسارة المحايدة أو أيونات المنتجات. ومع ذلك ، الأيونات المحددة أو التحولات اللازمة ليتم تعريفها قبل تنفيذ التجارب. ونظرا لان مقاييس الطيف الكتلي العالية الاستبانة أصبحت أكثر شيوعا في مختبرات البحوث ، فان العينات المعقدة تخضع الآن للفحص الشائع باستخدام أساليب الحيازة غير المستهدفة والمعتمدة علي البيانات (DDA). وعلي النقيض من الفقدان المحايد التقليدي والفحص الأيوني للسلائف ، يمكن تحديد المركبات المرتبطة هيكليا بتحليل ما بعد الاقتناء7. في هذا العمل ، ونحن نظهر استراتيجية وضعناها تسمي تصفيه التجزئة التشخيصية (قوات الأمر الأمر)5،6، نهج مستقيم إلى الامام وسهل الاستخدام للكشف عن فئات كامله من المركبات داخل المصفوفات المعقدة. وقد تم تنفيذ هذه الوحدة في قوات الأمر الجديد في منصة مفتوحة المصدر ، MZmine 2 والمتاحة عن طريق تحميل MZmine 2.38 أو أحدث الإصدارات. الأمر الذي يسمح للمستخدمين بفحص مجموعات بيانات DDA بكفاءة لأطياف MS/MS التي تحتوي علي أيونات المنتجات و/أو الخسارة المحايدة التي يتم تشخيصها لفئات كامله من المركبات. الحد من قوات الأمر الذي هو أيونات المنتج المميزة و/أو الخسائر المحايدة لفئة من المركبات يجب ان يحددها المحلل.
علي سبيل المثال ، كل واحد من أكثر من 60 المختلفة فومونوزين فطري المحددة8،9 تمتلك سلسله الجانب tricarballylic ، التي تولد m/z 157.0142 (C6H5س5–) أيون المنتج علي تجزؤ [م-ح]– أيون4. ولذلك ، يمكن الكشف عن جميع والفيومونسنات المفترضة في عينه باستخدام قوات الوضع الخاصة عن طريق فحص جميع أطياف ms/ms داخل مجموعه بيانات DDA التي تحتوي علي البارز m/z 157.0142 المنتج أيون. المثل ، يمكن الكشف عن المركبات الكبريت عن طريق فحص مجموعات بيانات DDA لأطياف MS/MS التي تحتوي علي فقدان محايد تشخيصي 79.9574 Da (SO3)3. وقد تم تطبيق هذا النهج أيضا بنجاح للكشف عن الببتيدات دوري جديد5 والمنتجات الطبيعية التي تحتوي علي بقايا التربتوفان أو فينيلالانين6.
لإظهار فعاليه قوات الأمر الأمر وسهوله استخدامها داخل منصة MZmine10، قمنا بتطبيق هذا النهج علي تحليل الميكرومثانه فئة من أكثر من 240 السموم ذات الصلة هيكليا التي تنتجها سيانوكوبالامين المياه العذبة11,12,13.
والأكثر شيوعا هو السميات المزرقة المبلغ عنها ، مع المتجانس MC-LR (ليوسين [L]/ارجينين [R]) الأكثر كثيرا دراسة (الشكل 1). الطحالب المجهرية الاحاديه غير الريبوميه غير المشبعة بالمكورات العنقودية ، بيوسينثيسيزيد من قبل البكتيريا الزرقاء المتعددة أجناس بما في ذلك microcystis ، انابينا ، nostoc ، و planktothrix12،13. وتتكون من خمسه بقايا مشتركه واثنين من المواقع المتغيرة التي تحتلها الأحماض الامينيه L. ما يقرب من جميع الاشراف علي المخدرات تمتلك السمة β-الأحماض الامينيه 3-الامينيه-9-ميثوكسي-2 ، 6 ، 8-تريميثيل-10-فينيلعشاري-4 ، 6-دايندييك حمض (إدا) بقايا في الموقف 511. ويرد وصف جيد لمسارات التجزئة ms/ms من الاشراف علي الاشراف14،15؛ بقايا إدا هي المسؤولة عن ms/ms المنتج البارز ، m/z 135.0803 + (C9H11O +) وكذلك أيونات المنتجات الأخرى بما في ذلك m/z 163.1114 + (c11H 15 O +) (الشكل 2). ويمكن فحص مجموعات بيانات DDA غير المستهدفة من مقتطفات Microcystis الزنجاريه الخلوية لجميع المجهريات الموجودة باستخدام هذه الأيونات التشخيصية ، والتي منحت ان الميكرومثانه لديها بقايا إدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
قوات الأمر الذي هو استراتيجية المباشرة إلى الامام والسريع للكشف عن فئات كامله من المركبات, خاصه ذات الصلة لاكتشاف مركب المنتجات الطبيعية. ويتمثل أهم جانب من جوانب الأمر الهام في تحديد معايير تجزئه MS/MS المحددة للفئة المستهدفة من المركبات. في هذا المثال التمثيلي, وقد استخدمت قوات الأمر الذي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون هيذر روشان (المركز الكندي للثقافة الثقافية ، جامعه واترلو لتوفير ثقافة البكتيريا الزرقاء التي درست وسوسن أبو حراخ (جامعه كارلتون) للحصول علي المساعدة التقنية.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
