LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama
Summary
Tanı parçalanma, MZmine uygulanan filtreleme, bilinen ve bilinmeyen doğal ürünlerin tüm sınıflar için LC-MS/MS veri kümeleri ekrana zarif, post-edinme yaklaşımdır. Bu araç, analistin bileşiklerin tüm sınıfı için teşhis olarak tanımladığı ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara yönelik MS/MS spektrumlarını arar.
Abstract
Doğal ürünler genellikle tek bir bileşik yerine, yapısal olarak benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş. Ortak yapısal özellikleri nedeniyle, aynı sınıf içinde birçok bileşikler benzer MS/MS parçalanma geçmesi ve birkaç özdeş ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar var. Tanılama parçalanma filtreleme (DFF) amacı, belirli bir sınıfın tüm bileşiklerini, sınıf özel ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpları içeren MS/MS spektrumları için hedeflenen olmayan LC-MS/MS veri kümelerini taramadan karmaşık bir ekstrakte verimli bir şekilde algılayabilmelerdir. Bu yöntem, açık kaynak MZmine platformu içinde uygulanan bir DFF modülüne dayanmaktadır, örnek ekstreler, dört ayaklı Orbitrap veya dört ayaklı zaman-uçuş kütlesi gibi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağımlı edinimi tarafından analiz edilmelidir Analizörleri. Bu yaklaşımın ana sınırlaması, analist ilk olarak hangi ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpların hedeflenen doğal ürünlerin sınıfı için spesifik olduğunu tanımlamalıdır. DFF yeni bileşikler de dahil olmak üzere karmaşık bir örnek içinde tüm ilgili doğal ürünlerin sonraki keşfi için izin verir. Bu çalışma, biz Microcystis aeruginosa, mikrocystins üretimi için siyanobacteria neden belirgin bir zararlı alg çiçek ekstraktlarının taramaları ile dff etkinliğini göstermektedir.
Introduction
Tandem kütle spektrometresi (MS/MS), çatışmaya bağlı ayrışma (CID)1gibi aktivasyon enerjisinin uygulanması yoluyla bir öncülü iyon yalıtmasını ve parçalanma yapılmasını içeren yaygın olarak kullanılan bir kitle spektrometresi yöntemidir. Bir iyon parçalarının moleküler yapısına yakından bağlı olduğu şekilde. Doğal ürünler genellikle tek bir benzersiz kimyasal olarak yerine yapısal benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş2. Aynı biyosentetik sınıfın parçası olan yapısal olarak ilgili bileşikler genellikle paylaşılan ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar dahil olmak üzere anahtar MS/MS parçalanma özelliklerini paylaşır. Sınıf özel ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara sahip bileşikler için karmaşık örnekleri ekran yeteneği, potansiyel olarak yeni doğal ürünlerin keşfi için önde gelen bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için güçlü bir stratejidir3, 4 , 5 , 6. on yıllardır, tarafsız kayıp taraması ve düşük çözünürlüklü enstrümanlara yapılan habercisi iyon taraması gibi kütle spektrometresi yöntemleri, aynı nötr kayıp veya ürün iyonlarına sahip iyonların algılanmasına izin verdi. Ancak, deneyleri gerçekleştirmeden önce tanımlanması gereken belirli iyonlar veya geçişler. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometre araştırma laboratuvarlarında daha popüler hale gelmiştir gibi, karmaşık örnekler artık genellikle hedeflenen olmayan, veriye bağımlı edinme (DDA) yöntemleri kullanılarak ekranlaştırılmış. Geleneksel nötr kayıp ve öncü iyon taramasının aksine, yapısal olarak ilgili bileşikler Post-Acquisition Analizi7ile tespit edilebilir. Bu çalışmanın içinde, karmaşık matrisler içindeki bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için teşhis parçalanma filtreleme (dff)5,6, bir düz ileri ve Kullanıcı dostu bir yaklaşım geliştirdiğimiz bir strateji gösteriyoruz. Bu DFF modülü açık kaynak, MZmine 2 platformu ve MZmine 2,38 veya daha yeni bültenleri indirerek kullanılabilir içine uygulandı. DFF kullanıcıların verimli ürün iyon (lar) ve/veya nötr kaybı (ler) içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri ekran sağlar bileşiklerin tüm sınıfları için teşhis. DFF bir sınırlama karakteristik ürün iyonları ve/veya bileşik bir sınıf için nötr kayıplar analist tarafından tanımlanmalıdır.
Örneğin, her biri daha fazla 60 farklı fumonisin Mikotoksinler tanımlanan 8/8bir tricarballylic yan zincir sahip, bir m/z üretir 157,0142 (C6H5O5–) ürün iyon üzerine [M-H]– Ion4‘ ün parçalanma. Bu nedenle, bir örnekte tüm sözde fumonisinlerden belirgin m/z 157,0142 ürün iyon içeren bir DDA veri kümesi içinde tüm MS/MS Spectra taramasında dff kullanılarak tespit edilebilir. Benzer şekilde, sülflu bileşikler 79,9574 da (SO3)3tanı nötr kaybı içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri tarama tarafından tespit edilebilir. Bu yaklaşım, yeni döngüsel peptidler tespit etmek için de başarıyla uygulanmıştır5 ve triptofan veya Fenilalanin kalıntıları içeren doğal ürünler6.
DFF ve MZmine platformu10içinde kullanım kolaylığı etkinliğini göstermek için, biz microcystins (MCS) analizine bu yaklaşımı uyguladıysanız; tatlı su siyanobacteria11,12,13tarafından üretilen üzerinde 240 yapısal olarak ilgili toksinler bir sınıf.
En sık bildirilen cyanotoksinler MCS, MC-LR ile (leucine [L]/argine [R]) türdeş sıkça okudu (Şekil 1). MCS, mikrocystis, anabaena, nostis ve planktothrix12,13gibi multipl siyanobacteria cins ile biyosentezlenmiş monokikrik olmayan ribozomal heptapeptidler. MCs beş ortak kalıntıları ve L-amino asitler tarafından işgal iki değişken pozisyonları oluşur. Neredeyse tüm MCs bir karakteristik β-amino asit 3-amino-9-metoksi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoik asit (adda) pozisyonunda kalıntı 511. MCS MS/MS parçalanma yolları iyi açıklanan14,15; Adda kalıntı, önemli MS/MS ürün iyon, m/z 135,0803+ (c9H11O+) ve m/z 163,1114+ (c11h 15 gibi diğer ürün iyonlarından sorumludur. O+) (Şekil 2). Microcystis aeruginosa hücresel özler hedef olmayan DDA veri kümeleri, bu tanı iyonlarının kullanıldığı tüm mikrocystinler için ekranlı olabilir, Microcystins bir adda kalıntı var verilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF, özellikle doğal ürün bileşik keşfi için ilgili bileşiklerin tüm sınıfları algılamak için bir düz ileri ve hızlı bir stratejidir. DFF en önemli yönü bileşiklerin hedeflenen sınıf için özel MS/MS parçalanma kriterleri tanımlayarak. Bu temsili örnekte, M. aeruginosa hücresel ekstresinin Içinde bulunan MCS Içeren tüm adda kalıntılarını algılamak için dff kullanılmıştır. MCs büyük çoğunluğu bir adda kalıntı içerse de, bu pozisyonda diğer kalıntılar bilinmekted…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Heather Roshon (Kanadalı Phycological Kültür Merkezi, Waterloo Üniversitesi ve teknik yardım için Sawsan Abusharkh (Carleton Üniversitesi) çalıştı siyanobacteria kültürü sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
