Naturlig produkt oppdagelse med LC-MS/MS Diagnostic fragmentering filtrering: søknad om Microcystin analyse
Summary
Diagnostisk fragmentering filtrering, implementert i MZmine, er en elegant, post-oppkjøpet tilnærming til skjermen LC-MS/MS datasett for hele klasser av både kjente og ukjente naturlige produkter. Dette verktøyet søker MS/MS Spectra for produktet ioner og/eller nøytrale tap at analytikeren har definert som diagnostiske for hele klassen av forbindelser.
Abstract
Naturlige produkter er ofte biosynthesized som blandinger av strukturelt lignende forbindelser, snarere enn en enkelt sammensatt. På grunn av deres felles strukturelle funksjoner, mange forbindelser innenfor samme klasse gjennomgår lignende MS/MS fragmentering og har flere identiske produkt ioner og/eller nøytrale tap. Formålet med diagnostiske fragmentering filtrering (DFF) er å effektivt oppdage alle forbindelser av en gitt klasse i et komplekst ekstrakt ved screening ikke-målrettede LC-MS/MS datasett for MS/MS Spectra som inneholder klasse spesifikke produkt-ioner og/eller nøytrale tap. Denne metoden er basert på en DFF modul implementert innenfor åpen kildekode-MZmine plattform som krever prøve ekstrakter analyseres av data avhengig oppkjøpet på en høyoppløselig masse spektrometer som quadrupole Orbitrap eller quadrupole time-of-Flight masse Analyserer. Den viktigste begrensningen av denne tilnærmingen er analytiker må først definere hvilke produkt-ioner og/eller nøytrale tap er spesifikke for målrettet klassen av naturlige produkter. DFF gjør det mulig for den påfølgende oppdagelsen av alle relaterte naturlige produkter innenfor en kompleks prøve, inkludert nye forbindelser. I dette arbeidet viser vi effektiviteten av DFF ved screening ekstrakter av Microcystis aeruginosa, en fremtredende skadelig alger blomst forårsaker cyanobakterier, for produksjon av mikrocystiner.
Introduction
Tandem masse massespektrometri (MS/MS) er en mye brukt masse massespektrometri metode som innebærer å isolere en forløper ion og inducing fragmentering via anvendelse av aktiveringsenergi som kollisjon indusert DISSOSIASJON (Cid)1. Måten en ion fragmenter er nært knyttet til sin molekylære struktur. Naturlige produkter er ofte biosynthesized som blandinger av strukturelt lignende forbindelser i stedet for som en enkelt unik kjemisk2. Som sådan, strukturelt relaterte forbindelser som er en del av den samme biosyntetiske klassen ofte deler nøkkelen MS/MS fragmentering egenskaper, inkludert delte produkt-ioner og/eller nøytrale tap. Evnen til skjermen komplekse prøver for forbindelser som besitter klasse-spesifikke produkt-ioner og/eller nøytrale tap er en kraftig strategi for å oppdage hele klasser av forbindelser, potensielt fører til oppdagelsen av nye naturlige produkter3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6. i flere ti år, masse massespektrometri metoder som nøytral tap skanning og forløper ion skanning utført på lav oppløsning instrumenter har tillatt ioner med samme nøytrale tap eller produkt ioner som skal oppdages. Men de spesifikke ioner eller overganger som trengs for å bli definert før du utfører eksperimentene. Som høyoppløselige masse spektrometre har blitt mer populært i forskningslaboratorier, komplekse prøver er nå vanligvis vist ved hjelp av ikke-målrettede, data-avhengige oppkjøp (DDA) metoder. I motsetning til tradisjonell nøytral tap og forløper ion skanning, strukturelt relaterte forbindelser kan identifiseres ved post-oppkjøpet analyse7. I dette arbeidet viser vi en strategi vi har utviklet kalt diagnostisk fragmentering filtrering (DFF)5,6, en rett fram og brukervennlig tilnærming for å oppdage hele klasser av forbindelser innen komplekse matriser. Denne DFF modul er blitt gjennomført inn i åpen-kilde, MZmine 2 plattform og anvendelig av dataoverfører MZmine 2,38 eller nyere befrir. DFF tillater brukere å effektivt skjermen DDA datasett for MS/MS Spectra som inneholder produktet ion (s) og/eller nøytral tap (e) som er diagnostiske for hele klasser av forbindelser. En begrensning av DFF er karakteristiske produkt ioner og/eller nøytrale tap for en klasse av forbindelser må defineres av analytikeren.
For eksempel, hver av de mer enn 60 forskjellige fumonisin mykotoksiner identifisert8,9 ha en tricarballylic side kjede, som genererer en m/z 157,0142 (C6H5O5–) Produktion upon fragmentering av [M-H]– ion4. Derfor kan alle antatte fumonisins i en prøve oppdages ved hjelp av DFF ved screening alle MS/MS Spectra innenfor en DDA datasett som inneholder den prominente m/z 157,0142 Produktion. Tilsvarende kan sulfated forbindelser oppdages ved screening DDA datasett for MS/MS Spectra som inneholder en diagnostisk nøytralt tap av 79,9574 da (SO3)3. Denne tilnærmingen har også blitt brukt for å oppdage nye sykliske peptider5 og naturlige produkter som inneholder tryptofan eller fenylalanin rester6.
For å demonstrere effektiviteten av DFF og dens brukervennlighet innenfor MZmine-plattformen10har vi brukt denne tilnærmingen til analyse av Mikrocystiner (MCS); en klasse av over 240 strukturelt relaterte giftstoffer produsert av ferskvann cyanobakterier11,12,13.
De hyppigst rapporterte cyanotoxins er MCs, med MC-LR (leucine [L]/Arginine [R]) congener hyppigst studert (figur 1). MCs er monocyclic ikke-ribosomal heptapeptides, biosynthesized av flere cyanobakterier slekter inkludert Microcystis, Anabaena, Nostoc, og Planktothrix12,13. MCs er sammensatt av fem vanlige rester og to variable posisjoner okkupert av L-aminosyrer. Nesten alle MCs besitter en karakteristisk β-aminosyre 3-amino-9-metoksy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoic acid (Adda) rester i posisjon 511. I MS/MS fragmentering trasé av MCS er godt beskrevet14,15; Adda rester er ansvarlig for det fremtredende MS/MS Produktion, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andre produkt ioner inkludert m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (figur 2). Ikke-målrettede DDA datasett av Microcystis aeruginosa Cellular ekstrakter kan bli vist for alle mikrocystiner tilstede ved hjelp av disse diagnostiske ioner, gitt at mikrocystiner har en Adda rester.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF er en rett-frem og rask strategi for å oppdage hele klasser av forbindelser, spesielt relevant for naturlig produkt sammensatte oppdagelse. Det viktigste aspektet ved DFF er å definere bestemte MS/MS fragmentering kriterier for målrettede klasse av forbindelser. I dette representative eksempelet ble DFF brukt til å oppdage alle Adda rester som inneholdt MCs som finnes i en M. aeruginosa Cellular ekstrakt. Selv om det store flertallet av MCs inneholder en Adda rester, har andre rester i denne stillingen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Heather Roshon (Canadian Phycological Culture Centre, University of Waterloo for å gi den cyanobakterier kulturen studert og sawsan Abusharkh (Carleton University) for teknisk assistanse.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
