Summary

Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.

Abstract

Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.

Introduction

A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença1. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influenciar a composição bacteriana e a diversidade da microbiota intestinal. Assim, as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana têm atraído a atenção crescente da pesquisa4,5,6,7,8,9.

É difícil avaliar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana in vivo devido à bioética e restrições econômicas. Por exemplo, experimentos que investigam as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana não podem ser realizados sem a permissão da administração de alimentos e drogas, e o recrutamento de voluntários é caro. Conseqüentemente, os modelos animais são usados frequentemente para tais investigações. No entanto, o uso de modelos animais é limitado devido a diferentes composições de microbiota e diversidade em comunidades animais vs. humanas associadas. Um método alternativo in vitro para explorar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana é através do uso de experimentos de cultura de lotes.

Os exopolissacarídeos (EPSs) são prebióticos que contribuem significativamente para a manutenção da saúde humana10. Os EPSS distintos que consistem em composições e em estruturas diferentes do monossacarídeos podem expor funções distintas. As análises prévias determinaram a composição de BIF EPSs, que são o xenobiótico representativo apontado no estudo atual11. No entanto, os efeitos metabólicos associados ao hospedeiro não foram considerados em relação à composição e diversidade do EPS.

O protocolo descrito aqui usa a microbiota fecal de 12 voluntários para fermentar bif EPSs. A cromatografia de camada fina (TLC), o sequenciamento do gene 16S rRNA de alta taxa de transferência e a cromatografia gasosa (GC) são então usadas em combinação para investigar as interações entre EPSs e microbiota intestinal humana. As vantagens distintas deste protocolo em comparação com experimentos in vivo são seu baixo custo e evitação de efeitos interferentes do metabolismo do hospedeiro. Além disso, o protocolo descrito pode ser utilizado em outros estudos que investiguem interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana.

Protocol

Este protocolo segue as directrizes do Comitê de éticas da Universidade de Hunan da ciência e da engenharia (Hunan, China), e da Universidade de Zhejiang GongShang (Zhejiang, China). 1. preparação de bactérias Preparação do caldo médio Bifidobacterium Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: extrato de carne, 5 g/L; extrato de levedura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glicose, 10 g/L; K2HPO4, 2, 4 g/L; M…

Representative Results

A produção de EPS mucoide pode ser observada em culturas de B. longum em placas de PYG após incubação anaeróbia por 72 h (Figura 1a). A centrifugação de raspagens de cultura, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS celulose-like (Figura 1b). EPS secos e amido solúvel foram então utilizados como fontes de carbono para culturas de fermentação. O TLC foi utilizado para análise de separação e pureza de oligo…

Discussion

Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos21,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de ciência da natureza da China (no. 31741109), a Fundação de ciência natural de Hunan (no. 2018JJ3200), e o programa de construção da disciplina característica aplicada na Universidade de ciência e engenharia de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) pela sua assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

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Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

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