Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения
Summary
Анализ вторжения клеток in vitro используется для измерения потенциала метастазирований рака путем количественной оценки клеточного потенциала для вторжения и миграции с помощью вставок клеточной культуры, содержащих белковую матрицу. Клетки бросают вызов, чтобы мигрировать через белковую матрицу и пористую мембрану, к хемоаттракторанту, а затем количественно с помощью световой микроскопии.
Abstract
In vitro анализ вторжения использует богатые белком матрицы в камере Бойден для измерения способности культивированных клеток пройти через матрицу и пористую мембрану в процессе, аналогичном первоначальным шагам метастазирования раковых клеток. Испытанные клетки можно изменить для выражения гена или обработать с ингибиторами для того чтобы испытать для изменений в потенциале нашествия. Этот эксперимент тестирует агрессивный фенотип клеточных опухолевых клеток мыши, чтобы обнаружить и охарактеризовать потенциальные онкогены, которые способствуют вторжению клеток. Этот метод, однако, может быть универсальным и адаптированы к различным приложениям. Сам эксперимент можно провести за один день, и результаты получены с помощью световой микроскопии менее чем за день. Результаты включают подсчет числа вторгшихся ячеек для сравнения и анализа. In vitro вторжения анализ является быстрым, недорогим и четким методом для определения поведения клеток в культуре, которые могут быть использованы в качестве первоначальной оценки, прежде чем более активное участие в vivo анализы.
Introduction
Анализ вторжения in vitro может быть полезным инструментом при измерении способности клетки мигрировать через мембрану с покрытием белка, по аналогии с первыми шагами в метастазах. Ключевой особенностью злокачественных раковых клеток является их способность мигрировать через и вторгаться в близлежащие ткани. Рак, который распространился или метастазы создает больше проблем лечения и имеет более низкие показатели долгосрочного выживания, в то время как локализованные опухоли легче поддаются лечению и имеют более высокие показатели долгосрочного выживания. Для метастазирования, раковые клетки должны покинуть первичную опухоль и мигрировать в кровеносную или лимфатическую систему, процесс, который требует прохождения через внеклеточной матрицы и подвальной мембраны1. В процессе, называемом эпителиальным мезенхимальным переходом (ЭМТ), опухолевые клетки должны разорвать контакты клеток клеток, мигрировать на правую сторону и вторгаться в близлежащие кровеносные или лимфатические сосуды. Первые шаги этого метастазов каскада представляют большой интерес, поскольку эти шаги, что может сделать рак смертоноснее. Генетические и эпигенетические факторы, участвующие в ранних этапах метастазов, находятся в центре внимания большого количества исследований, но точные и надежные экспериментальные инструменты необходимы для проверки этих ранних шагов как in vivo, так и in vitro.
Инструменты для измерения изменений в миграции клеток, такие как заживление ран (царапина) анализы или рост в 3D средах, таких как мягкие анализы агара может частично решить необходимость экспериментальных методов измерения ранних шагов метастазов, но анализ для измерения вторжения более сложным, поскольку процесс происходит в организме в сложной микросреде опухоли. Для целей скрининга наркотиков или изменения генов для определения важных факторов вторжения и метастазов, система, которая может быть использована в пробирке с культивированными клетками и имитировать проблемы, с которыми сталкиваются метастатические клетки in vivo является вторжение анализ2, 3. Рак молочной железы является наиболее часто диагностируется тип рака у женщин и второй ведущей причиной смерти от рака у женщин, поэтому понимание генов, ответственных за вторжение раковых клеток молочной железы и метастаз я критически важно для общественного здравоохранения. Кроме того, мышиные клетки являются полезной моделью системы для изучения рака молочной железы и его прогрессирования.
In vitro вторжения анализ основан на Бойден палаты ассамблеи, где две камеры роста средств массовой информации разделены пористой мембраны3. Для имитации микросреды опухоли, богатый белком гель также включен в отдельные клетки в одной камере от химиоаттрактора в другой и выступать в качестве мембранного барьера подвала. Для того, чтобы мигрировать к химиоаттрактору, клетки должны сначала пройти через богатый белком барьер, а затем пройти через пористую мембрану – процесс, аналогичный тому, как метастатические клетки мигрируют через стромы. Богатый белком гель может быть изменен в зависимости от потребностей эксперимента, но обычно состоит из коллагена, или экстракта мембраны в подвале (например, Matrigel)4. Это сложная смесь белков, протеогликанов и факторов роста, но в основном состоит из ламининов и коллагена IV 4,5. Клетки должны затем пройти через пористую мембрану, как правило, из поликарбоната, полиэстера или политетрафтотрилена (ПТФЕ). Мембраны могут быть приобретены на коммерческой приобрести с или без белка гель (как правило, коллагенов), или гель может быть приобретен отдельно и добавлены. Размер поры можно регулировать в зависимости от размера ячейки. В то время как размеры пор доступны от 0,4 до 8,0 мкм, только поры от 3,0 – 8,0 мкм достаточно велики для миграции клеток. Вторжение ассси был использован для определения эффективности ингибиторов на способность клеток мигрировать и вторгаться. Хотя не хватает точной микросреды опухоли, которая присутствует в vivo, in vitro вторжения анализ является полезным при скрининге многих условиях в течение короткого времени, сводя к минимуму потребность в животных моделей. Целью этих экспериментов является сравнение экспрессии генов подозреваемых онкогенов и определить влияние на поведение раковых клеток и агрессивность болезни с помощью анализа вторжения in vitro и других тестов. В целом, анализ вторжения обеспечивает последовательные, количественные и быстрые результаты для определения метастатического потенциала, а также является относительно недорогим, простым и адаптируемым методом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ вторжения in vitro является недорогим, быстрым, количественным и простым методом для изучения факторов, способствующих вторжению раковых клеток. Рак молочной железы является наиболее часто диагностируется рак среди женщин. Из трех основных подтипов рака молочной железы, тройной о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R15CA169978 от Национальных институтов здравоохранения. Дополнительное финансирование поступило от Университета Вилланова.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
