Coinkubations analyse til kvantificering af konkurrence interaktioner mellem Vibrio Stormhat isolater
Summary
Bakterier indkode forskellige mekanismer til at engagere sig i interbakteriel konkurrence. Her præsenterer vi en kultur baseret protokol til karakterisering af konkurrence interaktioner mellem bakterielle isolater, og hvordan de påvirker den rumlige struktur af en blandet befolkning.
Abstract
Dette manuskript beskriver en kultur baseret, coinkubations analyse til påvisning og karakterisering af konkurrencemæssige interaktioner mellem to bakterie populationer. Denne metode anvender stabile plasmider, som gør det muligt for hver population at blive differentielt mærket med forskellige antibiotikaresistens kapaciteter og fluorescerende proteiner til udvælgelse og visuel diskrimination af hver population, hhv. Her beskriver vi forberedelsen og coinkubationen af konkurrerende Vibrio Stormhat -stammer, Fluorescens mikroskopi Imaging og kvantitativ dataanalyse. Denne fremgangsmåde er enkel, giver hurtige resultater, og kan bruges til at afgøre, om en population dræber eller hæmmer væksten i en anden population, og om konkurrencen er medieret gennem et diffusible molekyle eller kræver direkte celle celle kontakt. Fordi hver bakteriepopulation udtrykker et andet fluorescerende protein, tillader analysen den geografiske diskrimination af konkurrerende populationer i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metoder udføres med symbiotisk bakterie V. Stormhat ved hjælp af betingelser, der er optimeret til denne art, kan protokollen tilpasses for de fleste bestemmelse antal kimtal bakteriel isolater.
Introduction
Dette manuskript skitserer en kultur-baseret metode til at afgøre, om to bakterielle isolater er i stand til konkurrencemæssige interaktioner. Når man studerer blandede populationer, er det vigtigt at vurdere, i hvilket omfang de bakterielle isolater interagerer, især om isolater konkurrerer direkte gennem interferens mekanismer. Interferens konkurrence refererer til interaktioner, hvor en population direkte hæmmer væksten eller dræber en konkurrent befolkning1. Disse interaktioner er vigtige at identificere, fordi de kan have dybtgående virkninger på en mikrobiel samfund struktur og funktion2,3.
Mekanismer for mikrobiel konkurrence er blevet opdaget bredt i genomer af bakterier fra forskellige miljøer, herunder både værts-associerede og frie levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En række forskellige konkurrencestrategier er blevet beskrevet10,11 herunder difsible mekanismer, såsom bakteriedræbende kemikalier1,12 og udskillet antimikrobielle peptider13 , samt kontaktafhængige mekanismer, der kræver celle celle kontakt for at overføre en hæmmende Effector til målcellerne9,14,15,16,17 ,18.
Selv om kulturbaserede coinkubationer almindeligvis anvendes i mikrobiologi5,8,19, skitserer dette manuskript, hvordan man bruger analysen til at karakterisere konkurrence mekanismen, samt forslag til tilpasning protokollen til brug sammen med andre bakteriearter. Desuden beskriver denne metode flere tilgange til at analysere og præsentere dataene for at besvare forskellige spørgsmål om karakteren af de konkurrencemæssige interaktioner. Selv om de teknikker, der er beskrevet her, tidligere blev anvendt til at identificere den interbakterielle dræbende mekanisme underliggende intraspecifik konkurrence mellem symbiotiske stammer af coisolerede Vibrio Stormhat bakterier19, er de velegnede til mange bakteriearter, herunder miljø isolater og humane patogener, og kan udnyttes til at evaluere både kontaktafhængige og difsible konkurrencemekanismer. Trin i protokollen kan kræve optimering for andre bakteriearter. Da flere modelsystemer udvider deres studier ud over brugen af isogene organismer til at omfatte forskellige genotyper10,16,20,21, vil denne metode være en værdifuld ressource for forskere, som søger at forstå, hvordan konkurrencen påvirker systemer med flere belastninger eller flere arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den coinkubations analyse, der er beskrevet ovenfor, giver en effektiv metode til at opdage interbakteriel konkurrence. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at identificere den intraspecifikke konkurrence mellem V. Stormhat isolater og karakteriseringen af konkurrence mekanismen19. Selv om den beskrevne metode blev optimeret til marine bakterien V. Stormhat, det kan nemt ændres til at rumme andre bakterielle arter, herunder kliniske og miljømæssige isolater. Det er vigtigt a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke anmeldere for deres nyttige feedback. A.N.S. blev støttet af Gordon og Betty Moore Foundation gennem Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
