I vivo Imaging av spinal Fluid transport gjennom intakt Mouse Skull bruker fluorescens Macroscopy
Summary
Transkraniell optisk tenkelig innrømmer bred-åker tenkelig av spinal Fluid transport inne det cortex av bo mus igjennom en Behold Skull.
Abstract
Spinalvæske (CSF) flyt i gnagere har i stor grad blitt studert ved hjelp av ex vivo kvantifisering av Bevegelsesuskarphet. Teknikker som to-Foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktivert in vivo kvantifisering av CSF flyt, men de er begrenset av redusert bildebehandling volumer og lav romlig oppløsning, henholdsvis. Nyere arbeid har funnet at CSF kommer inn i hjernen parenchyma gjennom et nettverk av inflammasjon mellomrom rundt saify og gjennomtrengende arterier av gnager cortex. Denne inflammasjon oppføring av CSF er en primær driver av glymphatic systemet, en sti innblandet i clearance av giftige metabolske oppløsninger (f. eks, amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk Imaging teknikk som gjør at sanntid, Mesoskopisk Imaging av fluorescerende CSF Bevegelsesuskarphet gjennom intakt skallen av levende mus. Denne minimalt-invasiv metode forenkler en rekke eksperimentelle design og muliggjør enkel eller gjentatt testing av CSF dynamikk. Macroscopes har høy romlig og tidsmessig oppløsning og deres store Portal og arbeidsavstand tillater bildebehandling mens du utfører oppgaver på atferds enheter. Denne Imaging tilnærmingen har blitt validert ved hjelp av to-Foton Imaging og fluorescens målinger innhentet fra denne teknikken sterkt relatere med ex vivo fluorescens og kvantifisering av radio-merket Bevegelsesuskarphet. I denne protokollen beskriver vi hvordan Transkraniell makroskopisk Imaging kan brukes til å evaluere glymphatic transport i levende mus, og tilbyr et tilgjengelig alternativ til mer kostbare bildebehandlings metoder.
Introduction
Spinalvæske (CSF) bader hjernen og ryggmargen og er involvert i å opprettholde homeostase, forsyne næringsstoffer, og regulere intrakraniell trykk1. CSF i subarachnoid plass inn i hjernen gjennom et nettverk av inflammasjon mellomrom (PVS) rundt kortikale saify arterier og deretter renner ned langs gjennomtrengende arterioler2. En gang i parenchyma, CSF utveksling med interstitiell væske (ISF), bærer skadelige metabolitter som amyloid-β (Aβ) og tau protein aggregater ut av hjernen gjennom lav motstand hvite materie traktater og perivenous mellomrom2,3 . Denne veien er avhengig av astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og har derfor blitt kalt gliacellene-lymfatisk (glymphatic) system4. Avfallsprodukter av neuropil er til slutt ryddet fra CSF-ISF gjennom lymfatisk fartøy nær skallen nerver og i hjernehinnene ut mot cervical lymfeknuter5. Svikt i dette systemet har vært innblandet i flere nevrologiske sykdommer som Alzheimers sykdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskemiske og hemoragisk hjerneslag8.
CSF transport kan bli visualisere av infusjonen Bevegelsesuskarphet inn i Cisterna magna (cm)9,10 og glymphatic studier i det siste har i hovedsak benyttet to-Foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI)14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for å evaluere Tracer Kinetics. To-Foton mikroskopi er en egnet metode for detaljert bildebehandling av CSF Bevegelsesuskarphet i PVSs og parenchyma på grunn av sin høye romlig oppløsning, men den har et smalt synsfelt og krever en invasiv skallen vindu eller tynning av skallen. Ex vivo Imaging, i kombinasjon med immunhistokjemi, gir flere nivåer analyser som spenner fra enkeltceller opp til hele hjernen19. Men prosessen med å ta av-fiksering som er nødvendig for å observere post-obduksjon vev produserer dyptgripende endringer i CSF Flow retning og kollapser i PVS, betydelig endre fordelingen og plasseringen av Bevegelsesuskarphet12. Til slutt, mens Mr kan spore CSF flyt gjennom hele murine og menneskelige hjerne, mangler det romlig og timelig oppløsning av inflammasjon flyt.
En ny teknikk, Transkraniell makroskopisk Imaging, løser noen av disse begrensningene ved å muliggjøre bred-feltet Imaging av inflammasjon CSF transport i hele rygg cortex av levende mus. Denne type av tenkelig er gjort med en epifluorescent macroscope benytter en Multiband filterene terningen, tunable smal avsats lyset kilde, og høy-effektiv CMOS kameraet10. Disse set-ups er i stand til å løse PVSs opp til 1-2 mm under hodeskallen overflaten og kan oppdage fluorophores opp til 5-6 mm under kortikale overflaten mens du forlater skallen helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder som raskt kan tune eksitasjon bølgelengde aktivere bruk av flere fluorophores slik at CSF å bli merket med Bevegelsesuskarphet av ulike molekylære vekter og kjemiske egenskaper i samme eksperiment.
Denne prosedyren krever en enkel, minimalt invasiv kirurgi for å eksponere skallen og plassere en lett hode plate å stabilisere hodet under bildebehandling økten. Bevegelsesuskarphet kan leveres inn i cm uten å bore inn i skallen eller trenge gjennom kortikale vevet med Pipetter eller kanyler9,20. Begge CM kanyler og hode platene forblir stabile i flere dager til uker og tilrettelegge for mer komplekse eksperimentelle design i forhold til den klassiske end-punkt visualisering. Denne protokollen beskriver hvordan Transkraniell makroskopisk Imaging brukes til å studere glymphatic systemfunksjon etter akutt eller kronisk injeksjon av fluorescerende CSF Tracer i CM av anesthetized/sovende eller våken mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en detaljert protokoll for å utføre Transkraniell CSF Imaging i levende mus ved hjelp av kommersielt tilgjengelige fluorescerende macroscopes og Bevegelsesuskarphet. Denne teknikken er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging samsvarer godt med følsomme metoder som flytende scintillation telling av radio-merket Bevegelsesuskarphet inkludert 3H-dextran og 14C-inulin etter cm levering, og med ex vivo koronale delen kvantifisering10, <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke og National Institute on aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske Networks of Excellence program, og EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram (Grant no. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gjerne takke Dan Xue for eksperthjelp med grafiske illustrasjoner.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
