In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie
Summary
Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.
Abstract
Cerebrospinale vloeistof (CSF) stroom bij knaagdieren is grotendeels bestudeerd met behulp van ex vivo kwantificering van tracers. Technieken zoals twee-Fobe microscopie en magnetische resonantie imaging (MRI) hebben in vivo kwantificering van de CSF-stroom ingeschakeld, maar ze worden beperkt door respectievelijk lagere beeld volumes en een lage ruimtelijke resolutie. Recent werk heeft geconstateerd dat CSF de hersen parenchym binnenkomt via een netwerk van perivasculaire ruimten rond de Piale en penetrerende slagaders van de knaagdieren cortex. Deze perivasculaire invoer van CSF is een primaire bestuurder van het glymphatische systeem, een traject dat betrokken is bij de klaring van toxische metabole opgeloste stoffen (bijv. amyloid-β). Hier illustreren we een nieuwe macroscopische beeldvormings techniek die real-time mesoscopische beeldvorming van fluorescerende CSF-tracers mogelijk maakt via de intacte schedel van levende muizen. Deze minimaal invasieve methode vergemakkelijkt een veelheid aan experimentele ontwerpen en maakt enkelvoudige of herhaalde tests van de CSF-dynamiek mogelijk. Macroscopen hebben een hoge ruimtelijke en temporele resolutie en hun grote portaal en werkafstand zorgen voor Imaging tijdens het uitvoeren van taken op gedrags apparaten. Deze beeldvormings benadering is gevalideerd met behulp van Two-photon Imaging en fluorescentie metingen verkregen uit deze techniek sterk correleren met ex vivo fluorescentie en kwantificering van radio-gelabelde tracers. In dit protocol beschrijven we hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming kan worden gebruikt om glymphatische transport in levende muizen te evalueren, en biedt een toegankelijk alternatief voor duurdere beeldvormings modaliteiten.
Introduction
Cerebrospinale vloeistof (CSF) bakt de hersenen en het ruggenmerg en is betrokken bij het handhaven van homeostase, leveren van voedingsstoffen, en regulering van intracraniële druk1. CSF in de subarachnoïde ruimte komt de hersenen binnen via een netwerk van perivasculaire ruimten (pv’s) rondom de corticale merg slagaders en stroomt vervolgens langs penetrerende arteriolen2. Eenmaal in het parenchym worden CSF-uitwisselingen met interstitiële vloeistof (ISF), die schadelijke metabolieten zoals amyloid-β (Aβ) en Tau-eiwit bevatten, uit de hersenen verzameld door middel van lage weerstand witte materie Tracts en periveneuze ruimten2,3 . Dit traject is afhankelijk van astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanalen en is daarom het glial-lymfatische (glymphatische) systeem4genoemd. Afvalproducten van de neuro pil worden uiteindelijk gewist uit het CSF-ISF via lymfevaten in de buurt van craniale zenuwen en in de hersenvliezen naar de cervicale lymfeklieren5. Het falen van dit systeem is betrokken bij verschillende neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer6,7, traumatisch hersenletsel3, en ischemische en hemorragische beroerte8.
CSF transport kan worden gevisualiseerd door het infusie tracers in de Cisterna magna (cm)9,10 en glymphatic studies in het verleden hebben voornamelijk gebruikt twee-photon microscopie4,11,12, 13, magnetische resonantie beeldvorming (MRI) 14,15,16,17en ex vivo imaging3,6,11, 18 om de Tracer kinetiek te evalueren. Two-photon microscopie is een geschikte methode voor gedetailleerde beeldvorming van CSF-tracers in PVSs en het parenchym vanwege de hoge ruimtelijke resolutie, maar het heeft een smal gezichtsveld en vereist een invasief craniaal venster of dunner worden van de schedel. Ex vivo imaging, in combinatie met immunohistochemie, maakt analyses op meerdere niveaus mogelijk, variërend van afzonderlijke cellen tot de hele hersenen19. Het proces van perfusie-fixatie dat nodig is om het postmortemweefsel te observeren produceert echter ingrijpende veranderingen in de CSF-stroomrichting en stort de PVS in, waardoor de verdeling en de locatie van de tracers12aanzienlijk veranderen. Tot slot, terwijl MRI de CSF-stroom over de gehele Murine en het menselijk brein kan volgen, ontbreekt het aan ruimtelijke en temporele resolutie van de perivasculaire stroming.
Een nieuwe techniek, Transcraniële macroscopische beeldvorming, lost sommige van deze beperkingen op door het inschakelen van Wide-veld beeldvorming van perivasculaire CSF transport in de gehele rugschors van levende muizen. Dit type beeldvorming wordt gedaan met een epifluorescerende macro scoop met behulp van een multiband filter kubus, Instelbare LED-lichtbron en hoogrenderende CMOS-camera10. Deze opstellingen zijn in staat om PVSs op te lossen tot 1-2 mm onder het schedel oppervlak en kunnen fluoroforen tot 5-6 mm onder het corticale oppervlak detecteren en de schedel volledig intact laten10. Multiband filters en Led’s die de excitatie golflengte snel kunnen afstemmen, maken het gebruik van meerdere fluor Foren mogelijk, waardoor CSF kan worden gelabeld met tracers van verschillende molecuulgewichten en chemische eigenschappen in hetzelfde experiment.
Deze procedure vereist een eenvoudige, minimaal invasieve ingreep om de schedel bloot te leggen en een lichtgewicht Hoofdplaat te plaatsen om het hoofd te stabiliseren tijdens de beeldvormings sessie. Tracers kunnen in de cm worden afgeleverd zonder in de schedel te boren of door het corticale weefsel te penetreren met pipetten of canules9,20. Zowel cm canules als hoofd platen blijven enkele dagen tot weken stabiel en faciliteren complexere experimentele ontwerpen in vergelijking met de klassieke eindpunt visualisatie. Dit protocol beschrijft hoe Transcraniële macroscopische beeldvorming wordt gebruikt om de glymphatische systeemfunctie te bestuderen na acute of chronische injectie van fluorescerende CSF Tracer in de CM van anesthetized/slapende of wakker muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren van Transcraniële CSF-beeldvorming in levende muizen met behulp van commercieel verkrijgbare fluorescerende macroscopen en tracers. Deze techniek is eenvoudig en minimaal invasief, maar toch kwantitatief. In vivo beeldvorming correleert goed met gevoelige methoden zoals vloeibare Scintillatie telling van radio-gelabelde tracers, waaronder 3H-dextran en 14C-inuline na cm levering, en met ex vivo coronale sectie kwantificering<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of neurologische aandoeningen and Stroke en het National Institute on Aging (U.S. National Institutes of Health; R01NS100366 en RF1AG057575 tot MN), het trans-Atlantisch netwerken van uitmuntendheid-programma van de Fondation Leducq en het EU Horizon 2020-onderzoeks-en innovatieprogramma (Grant No. 666881; SVDs @ target). Ook willen we dan Xue bedanken voor deskundige hulp bij grafische illustraties.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
