Summary

In vivo billeddannelse af cerebrospinalvæske transport gennem intakt mus kraniet ved hjælp af fluorescens makroskopi

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

Transcranial optisk billeddannelse tillader bred-felt billeddannelse af cerebrospinalvæske transport i cortex af levende mus gennem en intakt kraniet.

Abstract

Cerebrospinalvæske (CSF) flow i gnavere er stort set blevet undersøgt ved hjælp af ex vivo kvantificering af røbestoffer. Teknikker såsom to-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktiveret in vivo kvantificering af CSF flow, men de er begrænset af reduceret billeddannelse volumen og lav rumlig opløsning, hhv. Nylige arbejde har fundet, at CSF ind i hjernen parenkym gennem et netværk af perivaskulære rum omkring de piale og penetratere arterier af gnaver cortex. Denne perivaskulære indtræden af CSF er en primær drivkraft for det glymphatiske system, en vej, der er impliceret i clearance af giftige metaboliske opløfter (f. eks. amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk billedbehandlings teknik, der giver mulighed for realtids, mesoskopisk billeddannelse af fluorescerende CSF-røbestoffer gennem det intakte dødningehoved af levende mus. Denne minimalt-invasive metode letter en lang række eksperimentelle designs og muliggør en enkelt eller gentagen testning af CSF dynamik. Macroscopes har høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og deres store Gantry og arbejdsdistance giver mulighed for billeddannelse, mens de udfører opgaver på adfærdsmæssige enheder. Denne billeddannelses metode er blevet valideret ved hjælp af to-foton billeddannelse, og fluorescens målinger opnået fra denne teknik er stærkt korrelerer med ex vivo fluorescens og kvantificering af radiomærkede røbestoffer. I denne protokol beskriver vi, hvordan transcranial makroskopisk billeddannelse kan anvendes til at evaluere glyfatisk transport i levende mus, hvilket giver et tilgængeligt alternativ til dyrere billedbehandlings metoder.

Introduction

Cerebrospinalvæske (CSF) bader hjernen og rygmarven og er involveret i at opretholde homøostase, levering af næringsstoffer, og regulere intrakranielt tryk1. CSF i subarachnoid rummet kommer ind i hjernen gennem et netværk af perivaskulære rum (PVS) omgivende kortikale piale arterier og derefter strømmer ned langs penetrering arterioler2. En gang i parentchyma, CSF udvekslinger med interstitiel væske (ISF), transporterer skadelige metabolitter såsom amyloid-β (Aβ) og Tau protein aggregater ud af hjernen gennem lav modstand hvidt stof skrifter og perivenøse rum2,3 . Denne vej er afhængig af astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og er derfor blevet kaldt glial-lymphatic (glymphatic) system4. Affaldsprodukter af neuropil er i sidste ende ryddet fra CSF-ISF gennem lymfe skibe nær kranielle nerver og i meninges ud mod de cervikale lymfeknuder5. Svigt af dette system har været impliceret i flere neurologiske sygdomme som Alzheimers sygdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde8.

CSF transport kan visualiseres ved at inficere røbestoffer i Cisterna Magna (cm)9,10 og glymfatiske undersøgelser i fortiden har hovedsagelig udnyttet to-foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI) 14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for at evaluere Tracer kinetik. To-foton mikroskopi er en egnet metode til detaljeret billeddannelse af CSF røbestoffer i pvss og parenkym på grund af sin høje rumlige opløsning, men det har et snævert synsfelt og kræver en invasiv kraniel vindue eller udtynding af kraniet. Ex vivo-billeddannelse, i kombination med immun histokemi, muliggør analyser i flere niveauer, som spænder fra enkeltceller op til hele hjernen19. Men processen med perfusion-fiksering, der er nødvendig for at observere post mortem-væv producerer dybtgående ændringer i CSF flowretning og kollapser PVS, betydeligt ændre fordelingen og placeringen af røbestoffer12. Endelig, mens MRI kan spore CSF flow i hele murine og menneskelige hjerne, det mangler rumlig og tidsmæssig opløsning af perivaskulære flow.

En ny teknik, transcranial macroskopisk billeddannelse, løser nogle af disse begrænsninger ved at muliggøre vidfelt Imaging af perivaskulær CSF transport i hele rygbarken af levende mus. Denne type billeddannelse udføres med et epifluorescerende makroskop ved hjælp af en multi bånds filter kube, en tunbar LED-lyskilde og et højeffektivt CMOS-kamera10. Disse set-ups er i stand til at løse PVSs op til 1-2 mm under kraniets overflade og kan detektere fluorophorer op til 5-6 mm under den kortikale overflade, mens de forlader kraniet helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder, der hurtigt kan finjustere excitation bølgelængde gør det muligt at bruge flere fluorophorer tillader CSF at blive mærket med røbestoffer af forskellige molekylvægt og kemiske egenskaber i samme eksperiment.

Denne procedure kræver en enkel, minimalt invasiv operation for at udsætte kraniet og placere en letvægts hovedplade for at stabilisere hovedet under billedbehandlings sessionen. Røbestoffer kan leveres i cm uden boring i kraniet eller trænge ind i det kortikale væv med pipetter eller kanyle9,20. Både CM-kanyle og hovedplader forbliver stabile i flere dage til uger og letter mere komplekse eksperimentelle design sammenlignet med den klassiske endepunkts visualisering. Denne protokol beskriver, hvordan transcranial macroskopisk billeddannelse anvendes til at studere glymphatiske systemfunktion efter akut eller kronisk injektion af fluorescerende CSF Tracer i CM af bedøvet/sovende eller vågen mus.

Protocol

Alle eksperimenter blev godkendt af universitetets Komité for dyreressourcer (UCAR, protokol nr. 2011-023) ved universitetet i Rochester og udført i henhold til NIH guide for pleje og brug af forsøgsdyr. 1. klargøring af Cisterna Magna-kanyle, hovedplade og hoved holder Steriliser alle kirurgiske instrumenter og hovedplader før operationen.Bemærk: fluorescerende røbestoffer leveres direkte til CSF via en Cisterna Magna kanyle. For detaljerede anvisninger vedrørende denne …

Representative Results

CSF tilstrømning er afbildet på et epifluorescerende makroskop (figur 1a), som giver mulighed for mesoskopisk billeddannelse af CSF Tracer transport i murine cortex. Hele kraniets hovedplade tillader visualisering af de rostrale næse knogler, både frontal-og parietal knogler i midten, og den rostrale del af interparietalknoglen knogle caudally (figur 1b). Under billeddannelse kan der let identificeres nasofrontal, sagittal, koronal og lambdoid suturer (<stro…

Discussion

Vi har beskrevet en detaljeret protokol til udførelse af transcranial CSF Imaging i levende mus ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende makroskoper og Tracers. Denne teknik er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging korrelerer godt med følsomme metoder såsom flydende scintillationstælling af radiomærkede røbestoffer, herunder 3H-dextran og 14C-inulinsirup efter cm levering, og med ex vivo koronalsektion Section kvantificering10, <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske net of Excellence-programmet og EU Horizon 2020-programmet for forskning og innovation (Grant nr. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gerne takke Dan Xue for eksperthjælp med grafiske illustrationer.

Materials

0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane – Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

References

  1. Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
  2. Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
  3. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  4. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  5. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  6. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
  7. Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  8. Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
  11. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
  12. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
  13. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  14. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
  16. Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
  18. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
  19. Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
  20. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
  21. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
  22. Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
  25. Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
  26. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
  27. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  28. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  29. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
  30. Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
check_url/59774?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

View Video