Summary
Her, mus blod blev indsamlet i nærværelse af en anti-koagulans. Trombocytterne blev renset ved Iohexol gradient medium ved hjælp af lav hastighed centrifugering. Trombocytterne blev aktiveret med thrombin for at undersøge, om de var levedygtige. Kvaliteten af de rensede blodplader blev analyseret ved flow cytometri og mikroskopi.
Abstract
Blodplader renses fra fuldblod for at studere deres funktionelle egenskaber, som bør være fri for røde blodlegemer (RBC), hvide blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af tre gange mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og centrifugering i en svingende skovl rotor ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Genindvinding/udbytte af de rensede trombocytter var 18,2-38,5%, og de rensede blodplader var i hviletilstand, som ikke indeholdt et signifikant antal RBC og WBC. De rensede trombocytter, der blev behandlet med thrombin, viste en aktivering på op til 93%, hvilket indikerer deres levedygtighed. Vi bekræftede, at de rensede blodplader er tilstrækkeligt rene ved hjælp af flow cytometrisk og mikroskopisk evaluering. Disse blodplader kan bruges til genekspression, aktivering, granula frigivelse, aggregering, og vedhæftning assays. Denne metode kan bruges til rensning af blodplader fra blodet af andre arter samt.
Introduction
Trombocytter er en bestanddel af blod, der fungerer som en igangsætter af blodpropper som reaktion på skader i blodkar. De samles på stedet for skade til at sætte fartøjet væg1. Trombocytter er anucleate fragmenter af cytoplasma afledt af megakaryocytter af knoglemarv under indflydelse af trombopoietin og komme ind i cirkulation2. De betragtes som metabolisk aktive og i stand til at sensing ekstracellulære miljø ved at aktivere intracellulære signalering kaskader, der resulterer i trombocytspredning, aggregering, og hæmostatiske stik formation1,3. Udover hæmostase/trombose og sårheling4, spiller blodpladerne en vigtig rolle i Host inflammatoriske reaktioner, angiogenese, og metastatis3,5,6,7, 8. den er
Blodplader renses fra blodet for at studere deres biokemiske og fysiologiske egenskaber, som bør være fri for andre blodkomponenter. Da røde blodlegemer (RBC) og hvide blodlegemer (WBC) indeholder signifikant mere RNA og proteiner end blodplader9,10, tilstedeværelsen af selv et lille antal af disse celler kan forstyrre transkriptomic og proteomiske analyser af RNA proteiner afledt af blodplader. Vi konstaterede, at rensede blodplader aktiveret med Trombin binde antistof såsom anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mere effektivt end fuldblod plader.
Da trombocytterne er skrøbelige, er det vigtigt at behandle prøverne så mildt som muligt. Hvis trombocytterne er aktiveret, frigiver de deres granuler indhold og i sidste ende nedbrydes. Derfor, for at holde trombocytternes funktionelle egenskaber intakt, er det vigtigt at opretholde trombocytaggregation under isolation. Flere protokoller har beskrevet isolation af blodplader fra Human, hund, rotte, og ikke-menneskelige primat ved forskellige metoder1,10,11,12. Nogle af de metoder, der kræver flere trin såsom indsamling af trombocyttal-rige plasma ved centrifugering, filtrering ved separation kolonne, negativ udvælgelse af blodplader med RBC-og WBC-specifikke antistof konjugeret til magnetiske perler, og så videre, som er tidskrævende og kan forringe blodpladerne og deres indhold.
Ford og hans kolleger beskrev blodplade rensning fra humant blod ved hjælp af Iohexol medium11. Denne metode bruger en lignende volumen af blodprøve og medium under rensningen. Da mennesker giver en højere volumen af blod, er det relativt let at rense trombocytterne.
Iohexol er et universelt densitets gradient inert medium, der er frit opløseligt i vand og anvendes i fraktionering af nukleinsyrer, proteiner, polysaccharider og nucleoproteiner13,14. Det har lav osmolalitet og er giftfri, hvilket gør det til et ideelt medium til rensning af intakte levende celler11. Det er et ikke-partikel medium; Derfor kan fordelingen af celler i en gradient bestemmes ved hjælp af hemocytometer, flow cytometer eller spektrofotomometer. Det forstyrrer ikke det meste af den enzymatiske eller kemiske reaktion af cellerne eller cellulære fragmenter efter fortynding.
Musen tjener som en vigtig dyremodel for mange menneskelige sygdomme15,16,17,18. Der er et par udgivne artikler, der beskriver rensning af muse plader19,20. Men, musen giver en relativt mindre volumen af blod, hvilket gør det vanskeligt at rense blodplader. Hvis den samme lille mængde gradient medium og blodprøver anvendes, kan trombocytlaget ikke klart adskilles fra RBC-WBC-lag efter centrifugering. I denne artikel, vi har beskrevet en hurtig og enkel metode til mus trombocytoprensning med tre-fold mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og lav hastighed centrifugering. Vi har også aktiveret de rensede blodplader med Trombin og undersøgt deres kvalitet med flow cytometri og mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Almindeligvis isoleres blodpladerne ved centrifugering med lav hastighed, hvilket giver blodpladerigt plasma, der indeholder et betydeligt antal blodlegemer, cellulære rester og plasmaproteiner, som kan forstyrre de biokemiske og fysiologiske analyser og behov yderligere rensning21. Derfor er det vigtigt at bruge en hurtig og enkel metode, som kan give rene blodplader uden større forurenende stoffer. Den protokol, der præsenteres her beskriver rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en opstartsfinansiering af Cincinnati children’s Research Foundation og et University of Cincinnati pilot translational Grant til M.N. Vi vil gerne takke Cincinnati children’s Hospital Research flow cytometry Core for deres tjenester.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
