마우스 혈액에서 혈소판의 정제
Summary
여기서, 마우스 혈액은 항 응고 제의 존재 하에 수집 되었다. 혈소판을 저속 원심 분리를 이용 하 여 iohexol 구배 배지로 정제 하였다. 혈소판은 그들이 가능한 경우 조사 하기 위해 트 롬 빈과 함께 활성화 되었다. 정제 된 혈소판의 품질은 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다.
Abstract
혈소판은 적혈구 (RBC), 백혈구 및 혈장 단백질이 없어야 하는 기능적 성질을 연구 하기 위해 전 혈에서 정제 됩니다. 우리는 여기에서 혈액 샘플 부피에 비해 3 배 더 많은 iohexol 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판을 정제 하 고 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 의 스윙 버킷 회전자에서 원심 분리를 설명 한다. 정제 된 혈소판의 회수/수율은 18.2-38.5%이 고 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있었고,이는 상당한 수의 RBC 및 WBC를 포함 하지 않았다. 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판은 그들의 생존 율을 나타내는 최대 93%의 활성화를 보였다. 우리는 순화 된 혈소판이 유 세포 측정 및 현미경 평가를 사용 하 여 충분히 순수한 것을 확인 했습니다. 이러한 혈소판은 유전자 발현, 활성화,과 립 방출, 응집 및 유착 분석에 사용 될 수 있다. 이 방법은 뿐만 아니라 다른 종의 혈액에서 혈소판의 정제를 위해 사용 될 수 있다.
Introduction
혈소판은 혈관의 손상에 반응 하 여 혈액 응고의 개시 제로 서 기능 하는 혈액의 구성 요소입니다. 그들은 혈관 벽1을 연결 하기 위해 부상 부 위에 모여 있습니다. 혈소판은 thrombopoietin의 영향 하에 골의 거 핵 구 로부터 유래 된 세포질의 anucleate 단편 및 순환2로 진입 한다. 이들은 대 사적으로 활성인 것으로 간주 되며 혈소판 확산, 응집 및 지 혈 플러그 형성을 초래 하는 세포내 신호 전달 캐스케이드를 활성화 하 여 세포 외 환경을 감지할 수 있는1,3. 지 혈/혈전 증 및 상처 치유 외에4, 혈소판은 숙주 염증 반응, 혈관 신생 및 메타 스타 티 스3,6,7 에서 중요 한 역할을 한다 8.
혈소판은 혈액에서 그들의 생화학 적 및 생리 적 특성을 연구 하기 위하여 순화 됩니다, 다른 혈액 성분에서 자유로운 이어야 합니다. 적혈구 (RBC) 및 백혈구 (WBC)는 혈소판 보다 훨씬 더 많은 rna 및 단백질을 포함 하기 때문에10, 이러한 세포의 적은 수의 존재도 rna의 전사체 및 프로테오 믹 분석을 방해할 수 있습니다 및 혈소판에서 유래한 단백질. 우리는 정제 된 혈소판이 항 GPIIb/IIIa (존/A)와 같은 트 롬 빈 바인드 항 체와 함께 활성화 되 고 전 혈 혈소판 보다 더 효율적으로 항 P-selectin을 발견 했습니다.
혈소판이 깨지기 쉽기 때문에 샘플을 가능한 한 약간 치료 하는 것이 중요 합니다. 혈소판이 활성화 되 면, 그들은과 립 내용물을 방출 하 고 궁극적으로 저하. 따라서, 혈소판의 기능적 성질을 온전 하 게 유지 하기 위해, 분리 시에 혈소판을 유지 하는 것이 중요 하다. 여러 프로토콜은 다양 한 방법에 의해 인간, 개, 쥐 및 비 인간 영장류에서 혈소판의 분리를설명 했다. 일부 방법에는 원심 분리에의 한 혈소판 풍부 혈장 수집, 분리 칼럼에의 한 여과, RBC 및 WBC-특이 적 항 체가 자성 비드에 컨 쥬 게이 션 된 혈소판의 부정적인 선택 등 여러 단계가 필요 합니다. 시간이 많이 걸리고 혈소판과 그 내용물을 저하 시킬 수 있습니다.
포드 및 그의 동료는 iohexol 매체11을 사용 하 여 인간의 혈액에서 혈소판 정제를 설명 했다. 이 방법은 정제 중 혈액 샘플 및 배지와 유사한 양을 사용 한다. 인간은 혈액의 높은 볼륨을 양보 하기 때문에, 혈소판을 정화 하는 것이 상대적으로 쉽다.
Iohexol은 물에 자유롭게 용 해 되 고 핵 산, 단백질, 다 당 류 및 nucleoproteins13의 분별에 사용 되는 범용 밀도 구배 불활성 매 질 이다. 그것은 낮은 삼 투 압이 고 무 독성, 따라서 그것을 손상 되지 않은 살아있는 세포의 정제를 위한 이상적인 매체를 만들기11. 미 립 자형 매 질; 따라서, 기울기에서 세포의 분포는 혈액 세포종, 유 세포 계, 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 될 수 있다. 그것은 희석 후 세포 또는 세포 조각의 효소 또는 화학 반응의 대부분을 방해 하지 않습니다.
마우스는 많은 인간 질병에 대 한 중요 한 동물 모델의 역할을 한다15,16,17,18. 마우스 혈소판의 정제를 설명 하는 몇 가지 출판 문서가 있다19,20. 그러나, 마우스는 혈소판을 순화 하기 어렵게 만드는 혈액의 상대적으로 작은 양을 산출 합니다. 동일한 소량의 그라데이션 배지 및 혈액 샘플이 사용 되는 경우, 혈소판 층은 원심 분리 후에 RBC-WBC 층 으로부터 명확 하 게 분리 될 수 없다. 이 기사에서는 혈액 샘플 부피 및 저속 원심 분리에 비해 3 배 더 많은 iohexol 구배 배지를 가진 마우스 혈소판 정제의 빠르고 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리는 또한 트 롬 빈으로 순화 한 혈소판을 활성화 하 고 유 세포 분석 및 현미경 검사 법으로 그들의 질을 조사 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로, 혈소판은 혈액 세포, 세포 파편 및 생화학 적 및 생리 학적 분석 및 요구를 방해할 수 있는 혈장 단백질의 상당수를 포함 하는 혈소판 풍부 혈장을 생성 하는 저속 원심 분리에 의해 격리 됩니다 추가 정제21. 따라서, 주요 오염 물질 없이 순수한 혈소판을 얻을 수 있는 빠르고 간단한 방법을 사용 하는 것이 중요 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 저 속도 원심 분리?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 신시내티 아동 연구 재단의 신생 기금 및 M.N.에 신시내티 파일럿 번역 보조금의 대학에 의해 지원 되었다 우리는 그들의 서비스에 대 한 신시내티 어린이 병원 연구 흐름 세포 분석 코어 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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