여기서, 마우스 혈액은 항 응고 제의 존재 하에 수집 되었다. 혈소판을 저속 원심 분리를 이용 하 여 iohexol 구배 배지로 정제 하였다. 혈소판은 그들이 가능한 경우 조사 하기 위해 트 롬 빈과 함께 활성화 되었다. 정제 된 혈소판의 품질은 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다.
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이 논문에서
요약
초록
혈소판은 적혈구 (RBC), 백혈구 및 혈장 단백질이 없어야 하는 기능적 성질을 연구 하기 위해 전 혈에서 정제 됩니다. 우리는 여기에서 혈액 샘플 부피에 비해 3 배 더 많은 iohexol 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판을 정제 하 고 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 의 스윙 버킷 회전자에서 원심 분리를 설명 한다. 정제 된 혈소판의 회수/수율은 18.2-38.5%이 고 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있었고,이는 상당한 수의 RBC 및 WBC를 포함 하지 않았다. 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판은 그들의 생존 율을 나타내는 최대 93%의 활성화를 보였다. 우리는 순화 된 혈소판이 유 세포 측정 및 현미경 평가를 사용 하 여 충분히 순수한 것을 확인 했습니다. 이러한 혈소판은 유전자 발현, 활성화,과 립 방출, 응집 및 유착 분석에 사용 될 수 있다. 이 방법은 뿐만 아니라 다른 종의 혈액에서 혈소판의 정제를 위해 사용 될 수 있다.
서론
혈소판은 혈관의 손상에 반응 하 여 혈액 응고의 개시 제로 서 기능 하는 혈액의 구성 요소입니다. 그들은 혈관 벽1을 연결 하기 위해 부상 부 위에 모여 있습니다. 혈소판은 thrombopoietin의 영향 하에 골의 거 핵 구 로부터 유래 된 세포질의 anucleate 단편 및 순환2로 진입 한다. 이들은 대 사적으로 활성인 것으로 간주 되며 혈소판 확산, 응집 및 지 혈 플러그 형성을 초래 하는 세포내 신호 전달 캐스케이드를 활성화 하 여 세포 외 환경을 감지할 수 있는1,3. 지 혈/혈전 증 및 상처 치유 외에4, 혈소판은 숙주 염증 반응, 혈관 신생 및 메타 스타 티 스3,6,7 에서 중요 한 역할을 한다 8.
혈소판....
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프로토콜
마우스 혈액 수집은 적절 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 수행 해야 합니다.
참고: 혈소판 정제 프로토콜은 도 1의 흐름도에 기재 되어 있다.
1. 피의 수집
- 항 응고 제와 0.4 mM의 폴 리 프로필 렌 튜브에 3.2%의 7.2 구 연산 나트륨 µ l)을 첨가 합니다.
-
레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 C57BL/6 마우스에서 혈액의 약 200 µ L를 수집 합니다.
참고: 혈액은 연령과 성별에 관계 없이 모든 종류의 마우스 스트레인에서 수집 될 수 있습니다.- 모든 유형의 챔버에 아이 소 루 레인 2 mL를 사용 하 여 마우스를 마 취 시킵니다.
참고: 마 취의 깊이는 증가 된 호흡과 운동 감소의 징후에 의해 검사 됩니다. 마우스는 마 취 챔버의 움직임에 반응 하거나 처리 되지 않아야 한다. 마우스가 이동 또는 처리에 반응 하는 경우, 그것은 마 취 챔버에 유지 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. - 1.2.2 마우스 오른쪽 또는 왼쪽 눈 꺼 풀을 열고 눈....
- 모든 유형의 챔버에 아이 소 루 레인 2 mL를 사용 하 여 마우스를 마 취 시킵니다.
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결과
혈소판 정제의 요약은 흐름도 (도 1)에 기재 되어 있다. 단계는 항 응고 제 존재 하에서의 레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 마우스에서 혈액의 수집을 포함, iohexol 그라데이션 매체에 혈액 샘플의 추가, 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 에서 스윙 양동이로 터에서 원심 분리. 정제 된 혈소판의 품질은 임의의 오염 세포 및 활성화 된 혈소판을 검출 하기 위해 항 체로 염색 한 후 현미경 및 유 세포 분석기로 평가 되었다.
상기 iohexol 구배 배지와 혈액 샘플은 혈액이 중간에 서서히 첨가 되는 경우 튜브 내에 2 개의 별개의 층을 형성 하였다 (도 2a). 그러나이 단계에서 지연이 있는 경우, 대부분의 혈액 샘플은 배지로 확산 될 수 있으며 혈소판을 정화 하는 것이 어려울 수 있습니다. 넓은 보어 파이 펫 팁 혈소판의 무결성을 유지 하 고 .......
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토론
일반적으로, 혈소판은 혈액 세포, 세포 파편 및 생화학 적 및 생리 학적 분석 및 요구를 방해할 수 있는 혈장 단백질의 상당수를 포함 하는 혈소판 풍부 혈장을 생성 하는 저속 원심 분리에 의해 격리 됩니다 추가 정제21. 따라서, 주요 오염 물질 없이 순수한 혈소판을 얻을 수 있는 빠르고 간단한 방법을 사용 하는 것이 중요 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 저 속도 원심 분리와 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판의 정제를 설명 한다. 이 프로토콜에 사용 되는 파라미터는 수율을 최대화 하 고 혈소판의 분해를 최소화 한다. 상기 구배 매 질 및 혈장 단백질은 혈소판의 민감도를 증가 시킬 수 있는 아 고 니스 트 또는 항 체를 수집 한 후 세척 단계를 포함 함으로써 제거 될 수 있다. 가장 중요 한 것은, 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있지만, 트 롬 빈과 같은 작용 제의 존재 하에 활성화 될 수 있다. 우리는 트 롬 빈 활동이 다른 한 근원에서 변화 한다는 것을 발견 .......
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공개 사항
저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 신시내티 아동 연구 재단의 신생 기금 및 M.N.에 신시내티 파일럿 번역 보조금의 대학에 의해 지원 되었다 우리는 그들의 서비스에 대 한 신시내티 어린이 병원 연구 흐름 세포 분석 코어 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| APC 쥐 안티 마우스 / 인간 CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | 혈소판 활성화 마커 |
| Eppendorf 튜브 Fisher | Scientific | 14-222-166 | 원심 분리기 용 튜브 |
| FACS DIVA 소프트웨어 | BD Biosciences | 비 카탈로그 항목 | 혈소판 및 전혈 |
| FACS 튜브 | Fisher Scientific | 352008 | 튜브 흐름 cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | Non-catalog item | 혈소판 및 전혈 |
| 분석 FlowJo 소프트웨어 FlowJo | Inc. | 카탈로그 항목이 아닌 항목 | 소판 및 전혈 분석 |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | 혈소판 응고 형성 방지 |
| 헤마토크릿 모세관 Fisher | Scientific | 22-362566 | 채혈 모세관 |
| Hemavet | Drew Scientific | 카탈로그 제외 항목 | 혈액 세포 분석기 |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 3100 | 세포 계수 챔버 |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | 마우스 마취에 사용 |
| 현미경 (올림푸스 CKX41) | 올림푸스 | 비 카탈로그 항목 | 세포 모니터링 및 계산 |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | 구배 매체 |
| PE 쥐 안티 마우스 CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC 마커 |
| PE-Cy7 쥐 안티 마우스 TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC 마커 |
| 피펫 팁 200 &마이크로; L, 광역 | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | 혈액 및 혈소판 시료 이송 |
| Pipet tips 1000 µ L, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | 혈액 및 혈소판 시료 이송 |
| 인산염 강화 식염수(PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | 세척 및 희석용 완충액 |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653 | 생리식염수 |
| 구연산나트륨 | Fisher Scientific | 02-688-26 | 항응고제 |
| 염색 완충액 | 사내 | 비카탈로그 품목 | 및 희석 완충액 |
| Steile water | 사내 | 비카탈로그 품목 | 용매 |
| 테이블 상단 원심 분리기 | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | 스윙 버킷 로터 원심 분리기 |
| 트롬빈 | 효소 연구 Laboratoty | HT 1002a | 혈소판 활성화 작용제 |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Nycodenz 매체용 버퍼 |
참고문헌
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
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재인쇄 및 허가
