माउस रक्त से प्लेटलेट्स की शुद्धि
Summary
यहां, माउस रक्त एक विरोधी स्कंधी की उपस्थिति में एकत्र किया गया था । कम गति के अपकेंद्रण का उपयोग करके प्लेटलेट्स को आयोहेक्सॉल ग्रैडिएंट माध्यम से शुद्ध किया गया । प्लेटलेट्स थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय अगर वे व्यवहार्य थे की जांच कर रहे थे । शुद्घ प्लेटलेट्स की गुणवत्ता का विश्लेषण फ्लो सायटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया ।
Abstract
प्लेटलेट्स पूरे रक्त से शुद्ध कर रहे हैं उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, जो लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) से मुक्त होना चाहिए, सफेद रक्त कोशिकाओं (WBC), और प्लाज्मा प्रोटीन. हम यहां माउस रक्त से प्लेटलेट्स की शुद्धि का उपयोग तीन गुना अधिक iohexol ढाल माध्यम रक्त नमूना मात्रा और एक झूलते बाल्टी रोटर में ४०० x g पर 20 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर में अपकेंद्रण के सापेक्ष । शुद्घ प्लेटलेट्स की रिकवरी 18.2-385% थी, और शुद्ध किए गए प्लेटलेट्स एक विश्राम अवस्था में थे, जिसमें आरबीसी और WBC की कोई महत्वपूर्ण संख्या शामिल नहीं थी । थ्रोम्बिन के साथ इलाज किया शुद्ध प्लेटलेट्स ९३% सक्रियण तक दिखाया, उनकी व्यवहार्यता का संकेत है । हम पुष्टि की है कि शुद्ध प्लेटलेट्स पर्याप्त प्रवाह cytometric और सूक्ष्म मूल्यांकन का उपयोग कर शुद्ध कर रहे हैं । इन प्लेटलेट्स जीन अभिव्यक्ति, सक्रियण, ग्रेन्युल रिहाई, एकत्रीकरण, और आसंजन assays हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग अन्य प्रजातियों के रक्त से भी प्लेटलेट्स की शुद्धि के लिए किया जा सकता है ।
Introduction
प्लेटलेट्स रक्त का एक घटक है कि रक्त वाहिका में नुकसान के जवाब में रक्त के थक्के के एक प्रारंभकर्ता के रूप में कार्य कर रहे हैं । वे चोट के स्थल पर बर्तन दीवार1प्लग करने के लिए इकट्ठा । प्लेटलेट्स thrombopoietin के प्रभाव के तहत अस्थि मज्जा के megakaryocytes से व्युत्पंन कोशिका द्रव्य के anucleate टुकड़े कर रहे हैं और परिसंचरण2दर्ज करें । वे metabolically सक्रिय और intracellular संकेतन cascades है कि प्लेटलेट प्रसार, एकत्रीकरण, और hemostatic प्लग गठन1,3में परिणाम को सक्रिय करने से extracellular वातावरण संवेदन के रूप में माना जाता है । Hemostasis/थ्रोम्बोसिस और घाव भरने के अलावा4, प्लेटलेट्स मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और मेटास्टैटिस3,5,6,7, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ८।
प्लेटलेट्स रक्त से शुद्ध करने के लिए अपने जैव रासायनिक और शारीरिक गुण है, जो अंय रक्त घटकों से मुक्त होना चाहिए अध्ययन कर रहे हैं । के बाद से लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और सफेद रक्त कोशिकाओं (wbc) काफी अधिक शाही सेना और प्रोटीन प्लेटलेट्स9,10की तुलना में होते हैं, इन कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की उपस्थिति भी आरएनए के transcriptomic और proteomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और प्लेटलेट्स से प्राप्त प्रोटीन । हमने पाया है कि इस तरह के विरोधी के रूप में थ्रोम्बिन बांध एंटीबॉडी के साथ सक्रिय शुद्ध प्लेटलेट्स-gpiib/
के बाद से प्लेटलेट्स नाजुक हैं, यह संभव के रूप में हल्का के रूप में नमूनों का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि प्लेटलेट्स सक्रिय कर रहे हैं, वे अपने कणिका सामग्री जारी है और अंततः नीचा । इसलिए, प्लेटलेट्स के कार्यात्मक गुणों को बरकरार रखने के लिए, अलगाव के दौरान प्लेटलेट की निष्क्रियता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है । कई प्रोटोकॉल से प्लेटलेट्स की अलगाव मानव, कुत्ता, चूहा, और गैर मानव रहनुमा विभिंन तरीकों1,10,11,12द्वारा वर्णित है । कुछ विधियों में से कई चरणों की आवश्यकता होती है जैसे प्लेटलेट-रिच प्लाज्मा का एकत्रीकरण, पृथक्करण स्तंभ द्वारा निस्पंदन, आरबीसी के साथ प्लेटलेट्स का नकारात्मक चयन-और WBC-विशिष्ट एंटीबॉडी चुंबकीय मोतियों को संयुग्मित, और इतने पर, जो समय लेने वाली और प्लेटलेट्स और उनकी सामग्री को नीचा कर सकते हैं ।
फोर्ड और उनके सहयोगियों ने iohexol माध्यम11का उपयोग करते हुए मानव रक्त से प्लेटलेट शुद्धि का वर्णन किया । इस विधि को शुद्धि के दौरान रक्त के नमूने और माध्यम का एक समान मात्रा का उपयोग करता है । चूंकि मनुष्य अधिक मात्रा में रक्त प्राप्त करते हैं, इसलिए प्लेटलेट्स को शुद्ध करना अपेक्षाकृत आसान होता है ।
Iohexol एक सार्वभौमिक घनत्व ढाल अक्रिय माध्यम है कि स्वतंत्र रूप से पानी में घुलनशील है और न्यूक्लीय एसिड, प्रोटीन, पॉलीसैकेराइड, और न्यूकोप्रोटीन13,14के प्रभाजन में प्रयोग किया जाता है । यह कम परासरणीयता है और गैर विषैले है, इस प्रकार यह बरकरार रहने वाले कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक आदर्श माध्यम बना11. यह एक गैर-पर्टिकुलेट माध्यम है; इसलिए, एक ढाल में कोशिकाओं के वितरण hemocytometer, फ्लो cytometer, या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । यह कमजोर पड़ने के बाद कोशिकाओं या सेलुलर टुकड़ों के एंजाइमेटिक या रासायनिक प्रतिक्रिया के अधिकांश के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
चूहा कई मानव रोगों15,16,17,18के लिए एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है । वहां कुछ प्रकाशित लेख है कि माउस प्लेटलेट्स19,20की शुद्धि का वर्णन कर रहे हैं । हालांकि, चूहे रक्त की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा है, जो यह मुश्किल प्लेटलेट्स शुद्ध करने के लिए बनाता है पैदावार । यदि ग्रैडिएंट माध्यम और रक्त नमूनों की समान छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो अपकेंद्रण के बाद प्लेटलेट परत को आरबीसी-डब्ल्यूबीसी परत से स्पष्ट रूप से अलग नहीं किया जा सकता । इस अनुच्छेद में, हम तीन गुना अधिक iohexol ढाल मध्यम रक्त नमूना मात्रा और कम गति के अपकेंद्रण के सापेक्ष माध्यम के साथ माउस प्लेटलेट शुद्धि की एक त्वरित और सरल विधि का वर्णन किया है । हम भी थ्रोम्बिन के साथ शुद्ध प्लेटलेट्स सक्रिय है और प्रवाह कोशिका मिति और microscopy के साथ उनकी गुणवत्ता की जांच की ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आमतौर पर, प्लेटलेट्स कम गति के अपकेंद्रण जो पैदावार प्लेटलेट-अमीर प्लाज्मा कि रक्त कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या, सेलुलर मलबे, और प्लाज्मा प्रोटीन जो जैव रासायनिक और शारीरिक assays हैं और जरूरतों के सा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के एक स्टार्ट-अप फंडिंग सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन और सिनसिनाटी पायलट के एक विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया था । हम सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल अनुसंधान प्रवाह Cytometry कोर उनकी सेवाओं के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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