조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.
Summary
여기에서, 우리는 종양 을 지탱하는 마우스로의 그들의 전송 후에 항 혈관신생 종양 관련 호중구의 치료 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜은 생체외 호중구 활성을 조작하고 이후에 종양 을 개발하는 생체 내에서 그들의 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 그것은 잠재적인 호중구 기지를 둔 면역 요법을 공부를 위한 적당한 모형입니다.
Abstract
종양 발생의 조절에 호중구의 기여는 증가 관심을 받고있다. 이들 세포는 이질적이며, 종양에 따라 milieu는 프로-또는 항종양 용량을 보유할 수 있다. 종양 문맥에서 호중구 기능을 조절하는 중요한 사이토카인 중 하나는 타입 I 인터페론이다. 인터페론이있는 경우 호중구는 세포 독성 또는 면역 계통의 자극을 포함한 항 종양 특성을 얻습니다. 반대로, 인터페론 신호의 부재는 종양 혈관 신생의 강한 자극을 특징으로하는 눈에 띄는 프로 종양 활성을 초래합니다. 최근, 우리는 호중구의 친 혈관 신생 특성이 이들 세포에서 니코틴아미드 포스포리보실 트랜스퍼라제 (NAMPT) 신호 전달 경로의 활성화에 의존한다는 것을 입증 할 수 있었다. 종양 관련 호중구에서이 통로의 억제는 강력한 항 혈관 신생 표현형으로 이어집니다. 여기에서, 우리는 조작된 종양 관련 호중구 (TAN)의 종양성 잠재력의 생체 내 평가를 허용하는 우리의 새로 확립된 모형을 설명합니다. 곧, 프로-혈관신생 종양 관련 호중구는 종양 베어링 인터페론 결핍 마우스로부터 분리되고 NAMPT 신호의 차단에 의해 항 혈관신생 표현형으로 재편분화될 수 있다. 이들 세포의 혈관신생 활성은 대동맥 고리 분석술을 사용하여 이후에 평가될 수 있다. 항-혈관신생 TAN은 종양을 지탱하는 야생형 수용자로 옮겨질 수 있으며 종양 성장은 14일 동안 모니터링되어야 한다. 일째에 14 마우스는 희생되고, 종양은 그들의 혈관세포로 제거되고 절단됩니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 인공 호중구 세포주 모델을 사용할 필요 없이 종양 관련 호중구와 같은 1차 세포의 혈관신생 용량을 생체 내에서 평가하는 새로운 도구를 제공한다. Vc
Introduction
타입 I 인터페론(IFN)은 신생물에 대한 숙주 반응의 자극에 중요한 역할을 하며, I형 IFN 신호의결여는 종양 성장을 현저히 상승시키는 결과이다 1. 이 과정에 관여하는 메커니즘 중 하나는 종양 관련 호중구의 종양 성 활성의 조절이며, 이는 콜로니 자극 인자 3 수용체 (CSF3R) 다운스트림 신호에 의해 제어된다. 콜로니-자극 인자 3(CSF3) 또는 과립구 콜로니-자극 인자, 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 포함하는시그널링을 활성화시키는 것으로 나타났다 3,4. NAMPT는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 합성을 위한 속도 제한 효소로서, 이는 글리콜분해를 강화하고 DNA 수리, 유전자 발현 및 스트레스 반응을 조절하여 암세포의 생존및 증식을 촉진시킨다. 5. NAMPT는 대장, 난소, 유방, 위, 전립선암 및 글리오마 6을 포함하는다중 암 모형에서 과발현됩니다. NAMPT는 종양 세포뿐만 아니라 골수성 세포와 같은 종양에 존재하는 다양한 다른 세포 유형에 필수적입니다 – 그것은그들의 분화 4를 구동하고, 세포 자멸을 억제하고 다중 사이토카인의 발현을 자극하거나 대식세포에서 매트릭스 분해 효소7.
종양 관련 호중구는 종양 성장의 중요한 변조기를 나타냅니다. TAN 함수는 이들 사이토카인이 호중구의 항종양 활성을 주요화함에 따라 I IFN 유형의 가용성에 강하게 의존한다. 반대로 IFN의 부재는 이러한 세포, 특히 친 혈관 신생 특성의 종양 성 활성화를 지원합니다. 이에 동의하여 IFN결핍 마우스는 상당히 크고 더 나은 혈관화 종양을 개발하며, 이는 종양/친혈관성 호중구1, 2,8, 9,10. 중요한 것은, 이러한 친 혈관신생 TAn은 NAMPT의 높은 활성을 보여주며, 호중구의 종양 편광에 필수적인 역할을 시사합니다.
Ly6G 항체를 이용한 호중구의 고갈 또는 이들의 이동(CXCR2 항체)의 억제는 종양 혈관신생, 성장 및 전이 감소를 초래하는1,8. 그럼에도 불구하고, 생성된 단일클론 항체는 면역원성이며, 이들의 투여는 생명을 위협하는다양한 부작용(11)과 연관된다. 호중구 종양발생성을 조절하는 NAMPT 억제제 FK866과 같은 소분자를 치료하는 것은 그러한 합병증을 피하는 데 도움이 될 수 있다. 불행히도, 종양 성장에 대한 치료 효과 옆에 있는 NAMPT의 약리학적 전신 억제는 위장 독성 및 혈소판 감소증을 포함한 심각한 부작용을 초래한다. 따라서 NAMPT 억제제의 전신 적용은12,13,14.
이러한 이유로 NAMPT 활동이 격리된 TAN에서 직접 차단되는 프로토콜을 제안합니다. 이러한 항종양 호중구는 종양 베어링 숙주로 채택적으로 전달됩니다. 이 프로토콜은 화합물의 전신 독성 부작용을 피하는 데 도움이 될 것입니다., 대상 세포에 미치는 영향은 지속 될 것 이다 하는 동안.
Protocol
Representative Results
Discussion
외과 및 약리암 치료의 진행에도 불구하고 성공적인 치료는 여전히 도전과제로 남아 있습니다. 면역 세포는 종양 성장의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 세포의 종양 발생을 억제하는 새로운 방법이 확립되어야 한다. 여기에서 우리는 항 혈관신생 종양 관련 호중구의 입양 전달을 통해 종양 성장을 억제하는 새로운 접근법을 입증한다. FK866 억제제를 사용하여 탄에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리의 일은 도이치 크렙실페의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 번호: 111647, 독일 연구 위원회 (DFG), 보조금 번호: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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