Transferencia de neutrófilos asociados a tumores manipulados a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico en Vivo
Summary
Aquí, mostramos el potencial terapéutico de los neutrófilos anti-angiogénicos asociados a tumores después de su transferencia a ratones portadores de tumores. Este protocolo se puede utilizar para manipular la actividad de neutrófilos ex vivo y para evaluar posteriormente su funcionalidad in vivo en el desarrollo de tumores. Es un modelo adecuado para estudiar posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos.
Abstract
La contribución de los neutrófilos a la regulación de la tumorigenesis está recibiendo mayor atención. Estas células son heterogéneas, y dependiendo del entorno tumoral puede poseer capacidad pro o antitumoral. Una de las citoquinas importantes que regulan las funciones neutrófilas en un contexto tumoral son los interferones de tipo I. En presencia de interferones, los neutrófilos adquieren propiedades antitumorales, incluyendo citotoxicidad o estimulación del sistema inmunitario. Por el contrario, la ausencia de una señalización de interferón da lugar a una actividad protumoral prominente, caracterizada por una fuerte estimulación de la angiogénesis tumoral. Recientemente, podríamos demostrar que las propiedades pro-angiogénicas de los neutrófilos dependen de la activación de la vía de señalización de nicotinamida fosforibosiltransferasa (NAMPT) en estas células. La inhibición de esta vía en neutrófilos asociados a tumores conduce a su potente fenotipo anti-angiogénico. Aquí, demostramos nuestro modelo recientemente establecido que permite la evaluación in vivo del potencial tumorigénico de neutrófilos asociados a tumores manipulados (TAN). En poco tiempo, los neutrófilos pro-angiogénicos asociados a tumores pueden aislarse de ratones con deficiencia de interferón con tumores y repolarizarse en fenotipo antiangiogénico mediante el bloqueo de la señalización NAMPT. La actividad angiogénica de estas células se puede evaluar posteriormente mediante un ensayo de anillo aórtico. Los TAN antiangiogénicos se pueden transferir a receptores de tipo silvestre portadores de tumores y se debe controlar el crecimiento tumoral durante 14 días. En el día 14 ratones son sacrificados, los tumores se extirpan y se cortan con su vascularización evaluada. En general, nuestro protocolo proporciona una herramienta novedosa para evaluar in vivo la capacidad angiogénica de las células primarias, como los neutrófilos asociados a tumores, sin necesidad de utilizar modelos de líneas celulares de neutrófilos artificiales. Vc
Introduction
Los interferones tipo I (IFN) desempeñan un papel importante en la estimulación de las respuestas del huésped a las neoplasias, ya que la falta de señalización IFN de tipo I da como resultado un crecimiento tumoral significativamente elevado1. Uno de los mecanismos involucrados en este proceso es la regulación de la actividad tumorigénica de los neutrófilos asociados a tumores, que es controlada por el receptor del factor 3 estimulante de la colonia (CSF3R) señalización aguas abajo2. Se demostró que el factor 3 estimulante de colonias (CSF3), o factor estimulante de colonias de granulocitos, activa la señalización que implica nicotinamida fosfosibositransferasa (NAMPT)3,4. NAMPT es una enzima limitante de la tasa para la síntesis de dinucleótidos de adenina nicotinamida, que mejora la glucólisis y regula la reparación del ADN, la expresión génica y la respuesta al estrés promoviendo la supervivencia y proliferación de las células cancerosas5. NAMPT está sobreexpresado en múltiples tipos de cáncer, incluyendo colorrectal, ovario, mama, gástrico, cáncer de próstata y gliomas6. NAMPT es esencial no sólo para las células tumorales, sino también para una amplia variedad de otros tipos de células que están presentes en los tumores, tales como las células mieloides – impulsa su diferenciación4, inhibe la apoptosis y estimular la expresión de múltiples citoquinas o enzimas degradantes de matriz en macrófagos7.
Los neutrófilos asociados a tumores representan moduladores importantes del crecimiento tumoral. Las funciones TAN dependen en gran medida de la disponibilidad de IFN de tipo I, ya que estas citoquinas prima de la actividad antitumoral de los neutrófilos. Por el contrario, la ausencia de IFN apoya la activación tumorigénica de estas células, especialmente sus propiedades pro-angiogénicas. De acuerdo con esto, los ratones deficientes en IFN desarrollan tumores vascularizados significativamente más grandes y mejores, que están fuertemente infiltrados con neutrófilos protumorales/pro-angiogénicos1,2,8, 9,10. Es importante destacar que estos TAN pro-angiogénicos muestran una actividad elevada de NAMPT, lo que sugiere su papel esencial en la polarización protumoral de los neutrófilos.
El agotamiento de neutrófilos utilizando anticuerpos Ly6G o la inhibición de su migración (anticuerpo CXCR2) da como resultado una disminución de la angiogénesis tumoral, el crecimiento y la metástasis1,8. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales generados son inmunogénicos, y su administración se asocia con una serie de efectos secundarios potencialmente mortales11. El tratamiento con moléculas pequeñas, como el inhibidor de NAMPT FK866, que modulan la tumoriogenicidad de los neutrófilos, podría ayudar a evitar tales complicaciones. Desafortunadamente, inhibición sistémica farmacológica de NAMPT, junto a su efecto terapéutico sobre el crecimiento tumoral, conduce a efectos secundarios graves incluyendo toxicidad gastrointestinal y trombocitopenia. Por lo tanto, la aplicación sistémica de los inhibidores NAMPT no es factible12,13,14.
Por esta razón, sugerimos aquí un protocolo donde la actividad NAMPT se bloquee directamente en los TAN aislados. Estos neutrófilos antitumorales se transfieren de forma adoptiva a un huésped portador de tumores. Este protocolo ayudará a evitar efectos secundarios tóxicos sistémicos de los compuestos, mientras que su efecto sobre las células diana se mantendrá.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de los progresos en el tratamiento quirúrgico y farmacológico del cáncer, la terapia exitosa sigue siendo un desafío. Dado que se sabe que las células inmunitarias desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento tumoral, deben establecerse métodos novedosos que inhibidoran la tumorigeniidad de dichas células. Aquí demostramos un enfoque novedoso para suprimir el crecimiento tumoral a través de la transferencia adoptiva de neutrófilos asociados a tumores anti-angiogénicos. La focalizac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nuestro trabajo fue apoyado por subvenciones de Deutsche Krebshilfe, Número de Concesión: 111647, y Consejo Alemán de Investigación (DFG), Número de Subvención: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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