В vitro биохимические анализы с использованием биотина этикетки для изучения белково-нуклеиновой кислоты взаимодействия
Summary
Здесь представлены протоколы для биохимических анализов in vitro с использованием этикеток биотина, которые могут быть широко применимы для изучения белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий.
Abstract
Белково-нуклеиновые кислоты взаимодействия играют важную роль в биологических процессах, таких как транскрипция, рекомбинация, и метаболизм РНК. Экспериментальные методы изучения белково-нуклееновых кислотных взаимодействий требуют использования флуоресцентных меток, радиоактивных изотопов или других меток для обнаружения и анализа конкретных молекул-мишеней. Биотин, нерадиоактивный ярлык нуклеиновой кислоты, обычно используется в электрофоретической перекосной анализов (EMSA), но не регулярно используется для мониторинга активности белка во время нуклеиновых процессов. Этот протокол иллюстрирует полезность маркировки биотина во время ферментативных реакций in vitro, демонстрируя, что эта этикетка хорошо работает с целым рядом различных биохимических анализов. В частности, в соответствии с предыдущими выводами с использованием радиоизотопа 32P-маркированных субстратов, это подтверждается с помощью биотина помечены EMSA, что MEIOB (белок, специально участвующих в мейотической рекомбинации) является ДНК-связывающей белка, что MOV10 (an Рнк helicase) разрешает биотин-маркированные структуры дуплекса РНК, и что MEIOB расщепляет биотин-маркированную одноцепочечную ДНК. Это исследование показывает, что биотин способен заменить 32P в различных нуклеиновой кислоты связанных биохимических анализов в пробирке.
Introduction
Белково-ядерные кислоты взаимодействия участвуют во многих важных клеточных процессов, таких как ремонт ДНК, репликация, транскрипция, обработка РНК, и перевод. Белковые взаимодействия с конкретными последовательностями ДНК в хроматине необходимы для жесткогоконтроля экспрессии генов на транскрипционном уровне 1. Точная посттрансконсальная регуляция многочисленных кодирования и некодирования РНК требует обширных и сложных взаимодействий между любым белком и РНК2. Эти слои регулятивного механизма экспрессии генов составляют каскад динамических межмолекулярных событий, которые координируются взаимодействием транскрипционных/эпигенетических факторов или РНК-связывающих белков с их целями нуклеиновой кислоты, а также белково-белковых взаимодействий. Чтобы вскрыть ли белки in vivo прямо или косвенно связаны с нуклеиновыми кислотами и как такие ассоциации происходят и завершаются, в пробирке проводятся биохимические анализы для изучения связывающей сродства или ферментативной активности белков, представляющих интерес, разработанные субстраты ДНК и/или РНК.
Многие методы были разработаны для обнаружения и характеристики нуклеиновых кислотно-белковых комплексов, в том числе электрофоретической перекос асссепования (EMSA), также называют сярприг отсталости геля или перекладину полосы анализ3,4,5 . EMSA является универсальным и чувствительным биохимическим методом, который широко используется для изучения прямого связывания белков с нуклеиновыми кислотами. EMSA опирается на гель электрофоретический сдвиг в диапазонах, которые регулярно визуализированы с помощью хемилюминесценции для обнаружения биотина этикетки6,7, флуоресценция флюорофор этикетки8,9, или авторадиография радиоактивных 32P этикетки10,11. Другие цели биохимических исследований являются выявление и характеристика нуклеиновой кислоты обработки деятельности белков, таких как нуклеаза основе реакций для оценки декольте продуктов из нуклеиновой кислоты субстратов12, 13 Год , 14 и ДНК / РНК структуры раскручивания анализы для оценки деятельности геликей15,16,17.
В таких ферментативных анализов деятельности, радиоизотоп-маркированных или фторофора помечены нуклеиновые кислоты часто используются в качестве субстратов из-за их высокой чувствительности. Анализ радиографов ферментативных реакций с участием 32P помеченных радиотрафов было установлено, чувствительны и воспроизводимых18. Тем не менее, во все большем числе лабораторий в мире использование радиоизотопов ограничено или даже запрещено из-за рисков для здоровья, связанных с потенциальным воздействием. В дополнение к проблемам биобезопасности, другими недостатками являются необходимое оборудование для проведения работы с радиоизотопами, требуемая лицензия на радиоактивность, короткий период полураспада 32P (около 14 дней) и постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза. Таким образом, были разработаны альтернативные неизотопные методы (т.е. маркировка зонда флюорофорами позволяет обнаружить с помощью флуоресцентной визуализации19). Тем не менее, система визуализации с высоким разрешением необходима при использовании флуоресцентно помеченных зондов. Биотин, широко используемый ярлык, легко связывает к биологическим макромолекулам such as протеины и нуклеиновые кислоты. Система Biotin-streptavidin работает эффективно и улучшает чувствительность обнаружения без увеличения неспецифического фона20,21. Помимо EMSA, биотин широко используется для очистки белка и РНК выдвижной, среди прочего22,23,24.
Этот протокол успешно использует биотин-маркированные нуклеиновые кислоты как субстраты для биохимических анализов in vitro которые включают EMSA, в дополнение к enzymatic реакциям в которых биотин обыкновенно не был использован. MEIOB OB домен построен и два мутанта (усечение и точка мутации) выражаются как GST синтез атомиибелков 25,26,27, а также мыши MOV10 рекомбинантный белок слияния FLAG16. В этом докладе подчеркивается эффективность этого комбинированного протокола для очистки белка и биотин-маркированных анализов для различных экспериментальных целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование взаимодействия белково-нуклеиновой кислоты имеет решающее значение для нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе различных биологических процессов. Например, MEIOB является яичка конкретных белка, необходимого для мейоза и плодородия у млекопитающих<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим. Джереми Вана (Университет Пенсильвании) за полезные edits и обсуждения. Мы также благодарим Сигрид Экардт за редактирование языка. К. З. была поддержана Национальной программой исследований и разбироков Китая (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) и Национальным фондом естественных наук Китая (31771653). Л. Я. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу. J. N. была поддержана Чжэцзянской медицинской научно-технической проекта (2019KY499). М.Л. был поддержан грантами Национального фонда естественных наук Китая (31771588) и планом 1000 молодежных талантов.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA–protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3′-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O’Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5′ cap and protected against decapping: new tools to capture RNA – protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
