في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي
Summary
تُعرض هنا بروتوكولات للاختبارات البيوكيميائية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين التي قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة تفاعلات حمض البروتين والنوى.
Abstract
تلعب تفاعلات حمض البروتين والنوى أدوارًا هامة في العمليات البيولوجية مثل النسخ وإعادة التركيب والتمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي. تتطلب الطرق التجريبية لدراسة تفاعلات الأحماض النووية البروتينية استخدام علامات الفلورسنت أو النظائر المشعة أو التسميات الأخرى للكشف عن جزيئات مستهدفة محددة وتحليلها. البيوتين، وهو تسمية حمض نووي غير مشع، يستخدم عادة في اختبار التحول التنقل الكهربائي (EMSA) ولكن لم يتم استخدامه بانتظام لرصد نشاط البروتين أثناء عمليات الحمض النووي. يوضح هذا البروتوكول فائدة وضع العلامات على البيوتين أثناء التفاعلات الأنزيمية في المختبر، مما يدل على أن هذه التسمية تعمل بشكل جيد مع مجموعة من الاختبارات البيوكيميائية المختلفة. على وجه التحديد، تمشيا مع النتائج السابقة باستخدام النظائر المشعة 32P-المسمى ركائز، وأكد عن طريق EMSA المسمى البيوتين أن MEIOB (بروتين تشارك على وجه التحديد في إعادة تركيب meiotic) هو بروتين الحمض النووي ملزمة، أن MOV10 (وهو حل حالة طائرات الهليكوبتر RNA) الهياكل المزدوجة RNA المسمى البيوتين، وأن MEIOB يشق الحمض النووي الذي يحمل اسم البيوتين. توضح هذه الدراسة أن البيوتين قادر على استبدال 32P في مختلف الاختبارات الكيميائية الحيوية المتعلقة بالحمض النووي في المختبر.
Introduction
وتشارك تفاعلات حمض البروتين والنوى في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل إصلاح الحمض النووي، والنسخ المتماثل، والنسخ، ومعالجة الحمض النووي الريبي، والترجمة. التفاعلات البروتينية مع تسلسل الحمض النووي محددة داخل الكروماتين مطلوبة للسيطرة الصارمة على التعبير الجيني في المستوى النسخي1. التنظيم الدقيق بعد النسخ من العديد من الترميز وعدم الترميز RNAs يتطلب تفاعلات واسعة ومعقدة بين أي بروتين وRNA2. هذه الطبقات من آلية تنظيم التعبير الجيني تشمل سلسلة من الأحداث الديناميكية بين الجزيئيات، والتي يتم تنسيقها من خلال تفاعلات العوامل النسخ / الجيني أو البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي مع أهدافها حمض نووي، فضلا عن تفاعلات البروتين والبروتين. لتشريح ما إذا كانت البروتينات في الجسم الحي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر مع الأحماض النووية وكيف تحدث مثل هذه الجمعيات وتتوج، في المختبر يتم إجراء الاختبارات الكيميائية الحيوية لدراسة التقارب ملزمة أو النشاط الأنزيمي من البروتينات ذات الأهمية على تصميم ركائز الحمض النووي و / أو الحمض النووي الريبي.
وقد تم تطوير العديد من التقنيات للكشف عن وتوصيف المجمعات حمض النووي البروتين، بما في ذلك اختبار التحول التنقل الكهربائي(EMSA)، وتسمى أيضا اختبار التخلف هلام أو الفرقة التحول اختبار 3،4،5 . EMSA هو طريقة كيميائية حيوية متعددة الاستخدامات وحساسة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الربط المباشر للبروتينات مع الأحماض النووية. EMSA يعتمد على التحول الكهربائي هلام في العصابات، والتي يتم تصورها بشكل روتيني باستخدام chemiluminescence للكشف عن تسميات البيوتين6،7، الفلورة من تسميات فلوروفور8،9،أو عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي للأشعة 32P التسميات10،11. أغراض أخرى من الدراسات البيوكيميائية هي تحديد وتوصيف نشاط معالجة الحمض النووي للبروتينات، مثل التفاعلات القائمة على النوى لتقييم المنتجات الانقسام من الركيزات حمض نووي12، 13 , 14 والحمض النووي / الحمض النووي الريبي هيكل الفك الاختبارات لتقييم أنشطة طائرات الهليكوبتر15،16،17.
وفي مثل هذه الاختبارات الأنزيمية، كثيراً ما تستخدم الأحماض النووية التي تحمل اسم النظائر المشعة أو التي تحمل اسم الفلوروفور كركائز بسبب حساسيتها العالية. وقد تبين أن تحليل التصوير الإشعاعي لردود الفعل الأنزيمية التي تنطوي على 32P المسمى radiotracers حساسة واستنساخ18 . ومع ذلك، ففي عدد متزايد من المختبرات في العالم، يكون استخدام النظائر المشعة مقيداً أو حتى محظوراً بسبب المخاطر الصحية المرتبطة بالتعرض المحتمل. وبالإضافة إلى الشواغل المتعلقة بالسلامة الأحيائية، تتمثل العيوب الأخرى في المعدات اللازمة اللازمة للقيام بأعمال مع النظائر المشعة، وترخيص النشاط الإشعاعي المطلوب، وفترة نصف العمر القصيرة البالغة 32P (حوالي 14 يوما)، والتدهور التدريجي لنوعية المسبار بسبب الإنهاليس الإشعاعي. وهكذا، تم تطوير أساليب بديلة غير متساوية النظائر (أي أن وضع العلامات على المسبار بالفلوروفوريس يمكّن من الكشف عن طريق التصوير الفلوري19). ومع ذلك، هناك حاجة إلى نظام تصوير عالي الدقة عند استخدام تحقيقات تحمل علامة الفلورسنت. البيوتين، وهي تسمية شائعة الاستخدام، يرتبط بسهولة إلى الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات والأحماض النووية. البيوتين-streptavidin نظام يعمل بكفاءة ويحسن حساسية الكشف دون زيادة خلفية غير محددة20،21. إلى جانب EMSA، يستخدم البيوتين على نطاق واسع لتنقية البروتين وRNA سحب إلى أسفل، من بين أمور أخرى22،23،24.
يستخدم هذا البروتوكول بنجاح الأحماض النووية التي تحمل اسم البيوتين كركائز للاختبارات البيوكيميائية في المختبر التي تشمل EMSA، بالإضافة إلى التفاعلات الأنزيمية التي لم يتم استخدام البيوتين فيها بشكل شائع. يتم بناء المجال OB MEIOB ويتم التعبير عن اثنين من المسوخ (اقتطاع ونقطة طفرة) كما GST البروتينات الانصهار25،26،27، وكذلك الماوس MOV10 المؤتلف علم الانصهار البروتين16. ويسلط هذا التقرير الضوء على فعالية هذا البروتوكول المشترك لتنقية البروتين والاختبارات التي تحمل علامة البيوتين لأغراض تجريبية متنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التحقيق في تفاعلات الحمض النووي البروتين أمر بالغ الأهمية لفهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء العمليات البيولوجية المتنوعة. على سبيل المثال، MEIOB هو بروتين الخصية محددة ضرورية لmeiosis والخصوبة في الثدييات25،26،27. MEIOB يحتوي على مجال OB الذي ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ب. جيريمي وانغ (جامعة بنسلفانيا) على المناقشات والمناقشات المفيدة. كما نشكر سيغريد إيكاردت على تحرير اللغة. تم دعم K. Z. من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2016YFA0500902، 2018YFC1003500) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). تم دعم L. Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502، 31871503) وبرنامج الابتكار وريادة الأعمال في مقاطعة جيانغسو. J. N. بدعم من تشجيانغ الطبية للعلوم والتكنولوجيا المشروع (2019KY499). تم دعم M. L. من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771588) وخطة المواهب الشبابية 1000.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA–protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3′-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O’Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5′ cap and protected against decapping: new tools to capture RNA – protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
