Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59836
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

Abstract

הvivo לשעבר של תאי גזע אנושיים המטבטיים הוא מודל נפוץ לחקר המטפיאה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא עבור ציטוקינים המושרה הבידול של CD34+ המטפאות גזע ובתאי מחולל לארבעה תאים השושלת המייאלואידית. CD34+ תאים מבודדים דם טבורי הטבור האנושי ושיתוף תרבותי עם התאים MS-5 סטרומה בנוכחות של ציטוקינים. האפיון האימונוophenic של התאים גזע ומחולל קדמון, ואת התאים הבדיל מיאלואידית היוחסין מתוארים. באמצעות פרוטוקול זה, CD34+ תאים עשויים להיות מודבטים עם מולקולות קטנות או התמרה עם וירוסים כדי לבטא מוטציות המחלה מיאלואידית לחקור את השפעתם על בידול מיאלואידית.

Introduction

בידול רגיל של תאי גזע המטפאות (HSCs) הוא קריטי עבור תחזוקה של רמות פיזיולוגיות של כל תאי הדם הזמן. במהלך הבידול, בתגובה מתואמת כדי להביא רמזים מתוך כולל גורמי גדילה וציטוקינים, HSCs הראשון להצמיח לתאים רב-עוצמה (MPP) בתאי שיש להם פוטנציאל lympho-מיאלואידית1,2,3 ,4 (איור 1). MPPs להצמיח ושלתי מיאלואידית משותפת (CMPs) ו ושלתי הלימפה הנפוצות (CLPs) כי הם מוגבלים השושלת. CLPs להבדיל לתוך לתאי הלימפה המורכבת B, T, ואת התאים הטבעיים הרוצח. CMPs לייצר את לינאיד מיאלואידית באמצעות שתי אוכלוסיות מוגבלות יותר, מגקריוציט אריתרופואיד ושלתי (MEPs), ו גרנולוציט ושלתי (GMPs). MEPs להצמיח מגקריוציטים ו אריתרופוציטים, ואילו GMPs להצמיח גרנולוציטים ומונוציטים. בנוסף הנובעים דרך cmps, מגקריוציטים דווחו גם להתעורר ישירות מ HSCs או מוקדם mpps דרך שבילים לא קאנוניים5,6.

בתאי גזע ומחולל מצוי (HSPCs) מאופיינים על ידי סמן פני השטח CD34 וחוסר סמנים ספציפיים השושלת (לין-). סמנים פני השטח האחרים המועסקים בדרך כלל כדי להבחין בין אוכלוסיות HSCs ו מיאלואידית כוללות CD38, CD45RA, ו CD1232 (איור 1). HSCs ו-MPPs הם Lin-/cd34+/Cd38- ו-Lin-/cd34+/cd38+, בהתאמה. אוכלוסיית המייאלואיד המחויבת מאופיינת בנוכחות או היעדרות של CD45RA ו-CD123. Cmps הם lin-/cd34+/cd38+/cd45a-/cd123lo, gmps הם לין-/cd34+/cd38+/cd45a+/cd123lo, ו-meps הם לין-/cd34+ /Cd38+/cd45ra-/cd123-.

האוכלוסיה הכוללת של CD34+ גזע ותאים מחולל שיכול להיות מושגת בדם טבורי הטבורי דם (ucb), מח עצם, ו דם היקפי. CD34+ תאים מהווים 0.02% עד 1.46% של התאים הכולל של מונמונומנט (mncs) ב-ucb האנושיים, ואילו האחוזים שלהם משתנה בין 0.5% ל-5.3% במח העצם והוא נמוך בהרבה ב-~ 0.01% בדמו היקפי7,8,9 . היכולת ההתרבות והפוטנציאל לבידול של ucb נגזר CD34+ תאים הוא גבוה באופן משמעותי מזו של מח עצם או בתאי דם היקפיים1,10, ובכך מציע יתרון ייחודי להשגת חומר מספיק עבור ניתוחים מולקולריים בשילוב עם ביצוע האפיון אימונוopotypic ומורפולוגיים של התאים במהלך בידול.

Vivo הבדלה לשעבר של דם טבורי שנגזר CD34+ hspcs הוא מודל נרחב שהוחל לחקירת המטפיאה הרגילה ומנגנוני המחלה המטתית. כאשר מתורבתים עם ציטוקינים המתאים, ucb CD34+ hspcs יכול להיות המושרה להבדיל לאורך הלאואיד מיאלואידית או הלימפה11,12, 13,14,15 , 16. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבידוד האפיון החיסונית של CD34+ hspcs מן האדם ucb, ועל הבידול שלהם לתאי השושלת המייאלואידית. מערכת זו של התרבות מבוססת על הבידול cy, המושרה על ידי HSPCs בנוכחות של התאים מסטרומה MS-5 לחקות את מיקרוסביבה במח העצם. תנאי התרבות לגרום התרחבות ראשונית של CD34+ תאים, ואחריו בידול שלהם לתאים המבטאים סמנים עבור ארבעה תאים השושלת מיאלואידית, כלומר גרנולוציטים (CD66b), מונוציטים (CD14), מגה קריוציטים (CD41), ו אריתרופוציטים (CD235a). יישומים של CD34+ תא בידול הפרוטוקול כוללים מחקרים על מנגנונים מולקולריים הוויסות המטטוזיס, וחקירות של ההשפעה של מחלות מיאלואידית הקשורים מוטציות ומולקולות קטנות על התחדשות עצמית ו בידול של HSPCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דם טבורי אנושי לניסויים נתרם על-ידי אנשים בריאים לאחר הסכמה מושכלת לחקלאות משולבת מערכות בריאות (MIHS), פיניקס. היחידות המזוהות הושגו באמצעות הסכם העברת חומרים בין MIHS לבין אוניברסיטת אריזונה.

1. ריאגנטים ומאגרים

הערה: הכינו את כל הריאגנטים והמאגרים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי.

  1. הכינו מאגר של PBS-BSA-EDTA (PBE) על-ידי הוספת 7.2 מ"ל של סטרילי 35% סרום מדיום (BSA; השתמש בתרבית רקמה סטרילית כיתה 35% BSA) ו 5 מ ל סטרילי 0.5 M אתילן diamine חומצה אצטית (EDTA) ל-487.8 mL של פוספט באגירה של דולסין סטרילי תמיסת מלח (DPBS). המסנן מחטא את המאגר באמצעות השארת הפילטר המצורף לוואקום בארון בטיחות ביולוגי לפחות 2 שעות. מאגר הדלק הממגז בנפחים קטנים יותר (250 mL) ומאחסן ב -4 ° c.
  2. הכינו 1 x הנקס פתרון מאוזן (1x HBSS). לדלל 100 mL של מלאי 10x HBSS ב 900 mL של מים מזוקקים סטרילי לעשות 1 L של 1x HBSS ולהתאים את ה-pH ל 7.2. המסנן מחטא את ה-1x HBSS לפני השימוש.
  3. הכינו 2% חומצה אצטית תמיסה על ידי הוספת 2 מ ל של חומצה אצטית קרחוני כדי 98 mL של מים מזוקקים.
  4. הכן 20 ng/mL רקומביננטי פתרון קטע האדם fibronectin ב 1x PBS. הפוך את 10 mL לכל 48-צלחת.
  5. הכן 2% BSA. כדי 100 mL 1x PBS, להוסיף 2 גרם של שבר BSA V. מסנן לעקר לפני השימוש.
  6. הפוך את מדיום הנשר המלא של Dulbecco (DMEM) על-ידי הוספת אבקת DMEM, 3.7 gm נתרן ביקרבונט, 100 מ"ל בשור העוברי (FBS) ו-5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין (PS) כדי 800 mL של מים מזוקקים סטרילי. ערבב וליצור את עוצמת הקול ל 1 L, ומסנן לעקר לפני השימוש.
  7. הכינו בינוני מקפיא על ידי ערבוב 90 מ ל של FBS ו 10 mL של diמתיל סולפוקסיד סטרילי (DMSO).
  8. הכן גירוי בינוני. כדי סרום חינם בינוני, להוסיף L-גלוטמין כדי 2 מ"מ, ו ציטוקינים לריכוז הסופי של 50 ng/mL עבור מקדם תא גזע (scf), התרובפיאה (tpo), ו-fms-כמו טירוצין קינאז 3 ליגנד (Flt3L), ו 20 ng/mL עבור interleukin-3 (IL3) (ראה לוח חומרים להכנת פתרונות מניות ציטוקין. מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  9. הכינו מדיום בידול מיאלואיד 1x. כדי להשלים DMEM, להוסיף ציטוקינים לריכוז הסופי של 5 ng/mL עבור SCF, Flt3L, ו IL3, 50 ng/mL עבור TPO, ו 4 יחידות/mL עבור אריתרופויאטין (אריתרופואיטין). מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  10. הכינו מדיום לבידול 2x מיאלואיד. כדי להשלים DMEM להוסיף ציטוקינים לריכוז סופי 10 ng/mL עבור SCF, Flt3L, ו IL3, 100 ng/mL עבור TPO, ו-8 יחידות/mL עבור אריתרופואיטין. מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  11. הכינו את מאגר הזרימה. עד 1 ליטר של 1 x PBS, להוסיף 10 גרם של שבר BSA שבריר V.
  12. הכן 1% פאראפורמלדהיד ב-1x PBS (ראה טבלת חומרים לפרטים).
  13. הכנת פתרון פולי-L-ליזין על-ידי הוספת 500 μL של 10 מ"ג/mL פולי-L-ליזין כדי 49.5 mL של 1x PBS.

2. בידוד תאים מונמונומנט מחבל הטבור

הערה: עבור הפרוטוקול המתואר להלן, כמויות דם טבורי של 90 כדי 100 mL שימשו. הבידוד של CD34+ תאים יש לבצע בתנאים סטרילי בארון בטיחות ביולוגית.

  1. רסס את התיק המכיל UCB עם 70% אתנול לעקר את המשטח החיצוני לפני החדרת אותו לתוך הארון בטיחות ביולוגית. העברת UCB לתוך בקבוק פלסטיק סטרילי 250 mL ולדלל אותו 1:1 על ידי הוספת נפח שווה של טמפרטורת החדר (RT) 1x HBSS.
  2. מחלק 15 מ ל של מחקר בינוני MNC (MNC; ראה טבלת חומרים) לצינור לתוך שישה כשישה שפופרות חרוט 50 mL. הטה את השפופרת עם MFM, ובעדינות למזוג 30 מ ל של UCB מדולל על שכבת MFM מבלי להפריע לו.
  3. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 30 דקות ב-RT עם האצת איטי ללא בלם.
  4. לאחר צנטריפוגה, מאספירין בין 15-20 mL של פלזמה מעל שכבת MNC. בעדינות לאסוף את MNCs עם פיפטה ולהעביר לצינור חדש 50 mL חרוט.
    הערה: MNCs הפקדה כשכבת באפי לבן בממשק של פלזמה ו-MFM, ואת כדוריות הדם האדומות (RBCs) משקע בתחתית הצינור החרוט.
  5. בריכת MNCs שנאספו מ 2-3 צינורות ביחד. הפוך את הנפח של כל צינור ל 50 mL עם מאגר PBE קר.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם בלם על נמוך.
  7. ומקיש בעדינות על הצינורית. כדי לשחרר את הגלולה הסלולרית
  8. השהה מחדש את תאי ההחלקה ב-5 מ ל של מאגר הקירור הקר. השתמש באותו 5 mL של תאים מחדש הושעה כדי לאסוף תאים מצינורות אחרים. לשלב תאים מ 3 עד 4 צינורות יחד בצינור 1 50 mL.
  9. כדי לאסוף את כל התאים הנותרים, לשטוף את כל הצינורות עם 5 מ ל של מאגר PBE קר ולהוסיף את צינור 50 mL חרוט.
  10. לספור את MNCs על ידי דילול 10 μL של השעיית התא לתוך הפתרון חומצה אצטית 490 μL.
    הערה: חומצה אצטית למטה כל RBCs מזהם כדי לאפשר ספירה קלה יותר של MNCs.
  11. הפוך את נפח ההשעיה של התא ל 50 mL עם מאגר PBE קר קרח. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם בלם על נמוך.
    הערה: ההשעיה MNC עשוי להיות מעובד מיד עבור בידוד של CD34+ תאים או קפואים עבור יישומים מאוחרים יותר.
  12. כדי להקפיא את MNCs, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש בצפיפות של 2 x 107 תאים/mL בהקפאה בינונית ב RT.
  13. הקפא את התאים ב-80 ° c לילה בתא הקפאה מיכל ולאחר מכן העבר אותם לחנקן נוזלי.

3. בידוד CD34+ תאים מתאי מונמונומנט

  1. אם השימוש המבודד MNCs טרי להמשיך ישירות לשלב 3.3.
  2. אם באמצעות MNCs קפואים, במהירות להפשיר את התאים הקפואים באמבט מים 37 ° c ולהעביר לצינור מ50 mL חרוט. לאסוף את כל התאים הנותרים בבקבוקונים עם 1 מ ל של מאגר PBE קר קרח ולהעביר לצינור 50 mL.
  3. הפוך את הנפח של ההשעיה MNC ל 50 mL עם מאגר PBE קר וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  4. הסר את הסופרנטנט והקש על השפופרת בעדינות כדי לשחרר את הגלולה הסלולרית. להשעות מחדש את MNCs ל 1 x 108 תאים ב 300 μl של מאגר pbe קר קרח.
  5. הוסף 100 μL של FcR חסימה מגיב מיון תא מגנטי המופעל (מקינטוש) האנושית ערכת CD34 מיקרוחרוז לכל 1 x 108 mncs ולערבב בעדינות.
    הערה: זה חוסם מחייב לא ספציפי CD34 מיקרוחרוזי.
  6. הוסף 100 μL של CD34 מיקרוחרוזים לכל 1 x 108 תאים. מערבבים בעדינות ומודגרות ב -4 ° c עבור 30 דקות במקרר. . אל תירק על הקרח
  7. בעוד התאים מודונים, מניחים עמודת LS ומסנן טרום הפרדה בשדה המגנטי מפריד מקינטוש. באופן שולי את העמודה עם מאגר PBE קר קרח על ידי הוספת 2 מ"ל ישירות לתוך העמודה 1 מ ל במסנן טרום ההפרדה. אפשר לעמודה להתרוקן לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל ולהשליך את הזרימה.
  8. הסר את MNCs מ 4 ° c, להוסיף מאגר PBE קר קרח כדי ליצור את הנפח ל 15 מ"ל, ו צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם הבלם על נמוך.
  9. ולהשעות מחדש את התאים. ב-100 מ ל של מאגר הקרח הקר
  10. הוסף את השעיית התא למסנן טרום הפרדות הצבע הממוקם בעמודה LS.
    הערה: מסנן טרום הפרדה מסיר את כל אגרגטים התאים הגדולים שעלולים לחסום את העמודה.
  11. שטוף את השפופרת עם 3 מ ל של מאגר PBE קר קרח ולהוסיף אותו מסנן טרום הפרדה ממוקם על העמודה LS. לאחר מכן, מחק את מסנן טרום ההפרדה.
  12. לשטוף את עמודת LS ארבע פעמים על ידי הוספת 3 מ ל של מאגר PBE קר קרח, המאפשר לעמוד לנקז בכל פעם.
    הערה: התאים CD34+ יישארו מאוגדים לעמודה והתאים שאינם מתויגים יזרמו דרך העמודה.
  13. לאחר השטיפה הסופית, הסר את העמודה מהשדה המגנטי של מקינטוש ומניחים אותו בשפופרת חרוט חדשה של 15 מ"ל, הרחק מהמגנט.
  14. הוסף 5 מ"ל קרח קר מאגר PBE לעמודה ולגרש CD34+ תאים מאוגדים על ידי דוחף בחוזקה את הבוכנה.
  15. באופן אופציונלי, עבור CD34+ תאים מבודדים מהעמודה הראשונה בעמודת LS אחרת עם מסנן טרום הפרדה כמתואר לעיל (שלבים 3.10-3.13).
  16. לספור את CD34+ תאים מבודדים עם טרימין כחול (10 μl של תאים ו 10 μl של טרימין כחול) כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים חיים.
    הערה: בשלב זה, CD34 מבודדים+ תאים עלולים להיות קפואים לשימוש מאוחר יותר או עשוי להיות מעובד ישירות לניתוח של HSPCs על ידי הזרמת cy, בסעיף 4) או לבידול תאים השושלת המייאלואידית (סעיף 5).
  17. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 600 x g עבור 5 דקות ב-RT, עם בלם על נמוך.
  18. כדי להקפיא את התאים CD34+ , מאחד את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש עד 5 x 106 תאים ב 1 מ ל של הקפאת בינונית להקפיא כמתואר לעיל (שלב 2.13). . אחרת, המשך למחלקה 4 או 5

4. קביעת אוכלוסיות הגבעול והגזע על ידי הזרמת החוליות

  1. כדי לקבוע את השברים של אוכלוסיות גזע ומזרע ב-CD34 מבודדים טריים+ hspcs, צנטריפוגה אותם ב 600 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש 1 x 106 תאים ב 50 μl של זרם cy, לנסות מאגר.
  2. כדי 1 x 106 CD34+ תאים, להוסיף נוגדנים (לראות את הטבלה של חומרים לדילול) כדי סמני השושלת (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 ו-CD235A — כל שמסומנת FITC), CD34 (APC-Cy7), CD38 (pe), CD45RA (pe-), Cy7 (apc) ו-7- aminoactinomycin D (7-עמ מ; ככתם חי/מת) ולפצות על הנפח הכולל כדי 100 μL. מודטה על קרח בחשיכה במשך 20 דקות.
    הערה: פחות מ-1 x 106 CD34+ תאים עשוי להיות מועסק לניתוח. אם מכתים פחות תאים, הנפח הכולל וכמות הנוגדנים שנוספו יש לצמצם בהתאם. עבור הניתוח cy, בלתי מוכתם ומוכתם בודד MNCs יש להשתמש כפקדים עבור הגדרת שערים חיוביים ושליליים עבור כל fluorophore.
  3. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 1 מ ל של זרם cy, מאגר צילנסה וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות.
  4. באופן אופציונלי, לתקן את התאים ויטראז ב 0.5 mL של 1% הפתרון פאראמפורמלדהיד עבור 10 דקות בחושך ב-RT.
  5. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט.
  6. לשטוף את התאים קבוע/מוכתם עם 1 מ ל של זרימה cy, לנסות מאגר וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  7. משפל את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב-500 μL של זרימה cytometry מאגר, ולנתח על ידי הזרמת הזרימה (טבלת חומרים).

5. בידול מיאלואיד של CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

הערה: כדי להבדיל את CD34+ hspcs לתאי השושלת המייאלואידית, הם הגירוי הראשון של רקומביננטי האדם fibronectin מצופה לוחיות ולאחר מכן הופרה על שכבה של MS-5 מסטרומה תאים בתוך מדיום בידול מיאלואידית. בידול עשוי להיות מפוקח בכל שבוע במשך 3 שבועות מבוסס על ביטוי של סמנים משטח התאים ספציפיים לארבעת הדורות המייאלואידים. במהלך הגירוי והבידול, כל הincubations מתבצעים ב-37 ° c ו-5% CO2 בחדר מחולל לחות. יש לבצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגי.

  1. מעיל את הבארות של רקומביננטי סטרילי מ48 צופה לוחית-באר על-ידי הוספת 200 μL/טוב של הפתרון האנושי של fibronectin ב-1x PBS עבור 2 h ב RT.
  2. לאחר 2 h, בזהירות להסיר את הפתרון רקומביננטי האדם האנושי ולהשליך.
  3. לחסום את הבארות עם 200 μL/טוב של 2% BSA עבור 30 דקות at RT.
  4. מטפי את הפתרון BSA ולשטוף את הבארות פעמיים עם 500 μL של סטרילי 1x PBS.
    הערה: לוחות מצופים בחלק fibronectin עשויים להיות מאוחסנים ב -4 ° צ' עד 2 שבועות.
  5. כדי לעורר את CD34+ hspcs, להשעות מחדש את התאים הבודדים הטריים (משלב 3.17) בצפיפות של 1 x 105 תאים/200 μl או 5 x 105 תאים/mL של מדיום הגירוי 1x חם.
  6. אם באמצעות CD34+ תאים קפואים, במהירות להפשיר ולהעביר את התאים כדי 15 מ"ל שפופרת חרוט המכיל dmem חם להשלים. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ולהשעות מחדש את התאים כמתואר בשלב 5.5.
  7. צלחת 200 μL של CD34+ תא ההשעיה לכל טוב של הקטע fibronectin מצופה 48-ובכן צלחת ו דגירה עבור 48 h.
  8. ביום למחרת, זרע 15,000 MS-5 מסטרומה תאים ב 200 μL של DMEM מלאה לגמרי לאורך של 48-ובכן התרבות רקמה מטופלת לוחית ו דגירה ב 37 ° c עבור 24 h.
  9. לאחר 48 h של גירוי, לאסוף את התאים CD34+ ידי ליטוף עדין. לשטוף את הבארות עם 500 μL של DMEM חם ובריכה עם השעיית תא.
  10. . תספור את התאים עם טרי, כחול צנטריפוגה את ההשעיה ב 600 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש בצפיפות של 5,000 תאים/200 μl של בינוני מיאלואידית 1x בידול.
  11. מן 48-ובכן לוחית התרבות רקמה הנזרע עם התאים MS-5 סטרומה, בעדינות לחות את המדיום מבלי להפריע את התאים. שכבה 200 μL (5,000 תאים) של CD34+ תא ההשעיה לכל טוב של הצלחת ו-הדגירה ב 37 ° c.
    הערה: התרבות של התאים MS-5 יכול להישמר DMEM מלאה. ביום התאים CD34+ הם נזרע, התאים MS-5 חייב להיות בשכבה אחידה (80-90% המפגש). מומלץ כי התאים MS-5 מצופים לפחות 24 שעות לפני זריעה של CD34+ תאים.  אם MS-5 התאים הם להיות מצופה 48 h או 72 h לפני זריעת CD34+ תאים, צפיפות התא צריך להיות מותאם בהתאם. מומלץ גם כי הבארות ההיקפית של הצלחת 48-באר להיות ריק או מלא עם 200 μL של מים סטריליים כדי למנוע תופעות הקצה.
  12. ביצוע חצי בינוני שינוי כל 3 על 4 ימים על ידי הסרת בעדינות 100 μL של המדיום מלמעלה של כל באר והחלפתו עם 100 μL של מדיום 2x בידול מיאלואיד בנוסף לכל.
  13. ביום 21, לקצור את התאים לניתוח של ביטוי סמן השושלת המייאלואידית ידי הזרימה cytometry. מבלי להפריע את שכבת MS-5, בעדינות לנקז את התאים בינונית ולהעביר לצינור 5 מ ל.
    הערה: עבור כתמים וזרימה הניתוח cy, תאים מ 1-2 בארות מספיקים. ניתן גם לפקח על הבידול בימים 1, 7 ו -14. אם ביצוע הקלדה חיסונית במספר ימים, יש לחשב בהתאם את מספרי הבארות הדרושים לניתוח.
  14. כתם 5 x 105 תאים עם נוגדנים כדי CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (pe), CD41 (percp-cy 5.5), ו CD235A (APC) בנפח כולל של 50 Μl. דגירה בקרח בחושך עבור 20 דקות. כלול מוכתם ויטראז בודד מתוך הגדרה ושליטה שערים חיוביים ושליליים עבור כל fluorophore ו 7-עמ ככתם חי/מת לחסל תאים מתים מהניתוח.
  15. שטוף ותקן (אופציונלי) התאים המוכתמים כמתואר לעיל (שלבים 4.3-4.6).
  16. מחדש להשעות את התאים ב-500 μL של זרימה cy, לנסות מאגר ולנתח ידי cytometry זרימה.

6. הערכת מורפולוגיה סלולרית

  1. ניקוי שקופיות מיקרוסקופ על ידי התזת אתנול וניגוב עד סקוויקי.
  2. לטבול שקופיות נקיות בפתרון פולי-L-ליזין עבור 5 דקות ב-RT ויבש עבור 1 h ב RT.
  3. השהה מחדש את HSPCs משלב 3.14 ותאים מובחנים משלב 5.13 ב -10 μL של מאגר cy, הזורם.
  4. להעביר את ההשעיה התא לשקופיות מצופה ולהשאיר אותם להתייבש באוויר.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות מיום 1 ו -21 ביום ב-RT ומוכתמות בו.
  5. יוצקים 0.5 mL של הכתם רייט-Giemsa על השקופית ולתת לעמוד 3 דקות ב RT.
  6. להוסיף נפח שווה של מים מיולים ולתת לעמוד נוסף 10 דקות ב RT.
  7. שטוף את המגלשה. במים מוכי מלים
  8. הדמיה של תאים מוכתמים בהגדלה של 60x או 100x על ידי מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היישום של הפרוטוקולים הנ ל תשואות 5.6 (± 0.5) x 108 mncs ו 1 (± 0.3) x 106 CD34+ תאים מיחידת דם טבורי של ~ 100 mL. האחוז של סך CD34+ תאים נע בין 80-90% (איור 2א, ב). ניתוח אימונוophenic באמצעות הערכה המתוארת על ידי Manz ואח '5 ממחיש כי התאים CD34+ בדרך כלל מכילים של ~ 20% HSCs ו ~ 72% Mpps כי הם lin-/cd34+/cd38- ו-lin-/cd34+ /Cd38+, בהתאמה (איור 1 ואיור 2א). באוכלוסיית MPP, האחוזים של CMPs (Lin-/cd34+/cd38+/cd123לו/cd45ra-), gmps (lin-/cd34+/cd38 +/cd123lo/cd45ra+), ו-meps ((Lin-/cd34/cd45a) הםכ -25%, 15% ו-56%, בהתאמה (איור 1 ואיור 2b).

במהלך הדגירה של HSPCs מבודדים בתנאים הבידול מיאלואיד, יש אובדן מתמשך של סמן CD34. Immunophenotyping קלדה מראה כי האחוז של CD34+ תאים מפחית מ-~ 90% בבידוד (איור 2א) עד ~ 23% ביום 21 (איור 3ב). ניתוח של CD34- אוכלוסיה מדגים עלייה במקביל באחוז התאים המבטא סמנים בוגרים השושלת המייאלואידית. קיימת עלייה באחוז התאים המבטאים סמנים עבור מונוציטים (CD34-/cd14+/cdb-) מממוצע של 1.7% עד 12%, עבור גרנולוציטים (CD34-/cd14-/cd14+) מ 1.3% עד 5.3%, עבור מגקריוציטים(CD34/cd41+/cd235a-) מ-1.8% עד 8%, ועבור תאי אריתרופואיד (CD34-/cd41-/cd235a+) מ 0.7% עד 11% (איור 3ג). בחינת התאים המוכתמים של רייט-Giemsa ממחישה כי המאפיינים המורפולוגיים של התאים ביום 1 והיום 21 הם נפרדים. תאים מובחן יש גרעיני עגול גדול, ו ציטופלסמה מעט מאוד. מצד שני, תאים מתוך תרבויות הבדיל מאפייני התאים של השושלת כולל מונוציטים בוגרת, גרנולוציטים, ו אודם (איור 4). כך, תנאי התרבות המתוארים בפרוטוקול זה לקדם הבידול של UCB CD34+ תאים לתאי השושלת המייאלואידית.

Figure 1
איור 1 : שרטוט מצוי בבידול. תא הגזע המטאקאני החזק ביותר (HSC) מבדיל לתוך מחולל קדמון רב עוצמה (MPP), המעניק לחולל קדמון מיאלואיד משותף (CMP) ומחולל הלימפה המשותף (CLP). CMPs לייצר שני ושלתי מיאלואידית אחרים, ושלתי (GMPs) ו-מונוקריוציט אריתרופויוציטים ושלתי (MEPs). גרנולוציטים ומונוציטים נובעים מ-GMPs, ו אריתרופוציטים ומגקריוציטים נובעים MEPs. CLPs להצמיח הרוצח הטבעי, B, ו-T תאים. סמני פני השטח המשמשים לאפיון אוכלוסיית התאים בפרוטוקול זה מצוינים. דמות זו השתנתה מתוך באפו ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : ניתוח האימונוהנומטוסטי של הגזע המטמית והתאים הקדמון (א) תאים שהיו מגודרת בפיזור קדימה ובצד כדי לבחור אוכלוסיית תאים בודדת. תאים מתים חיוביים השושלת חוסלו על ידי כתמים עם 7-עמ מ ונוגדנים כדי CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19, ו CD235a (כל FITC מוכתם). התאים Lin-/live נותחו עם נוגדנים ל CD34 (Apc-Cy7), CD38 (pe), CD123 (apc), ו CD45RA (Pe-Cy7). הושלתי היו מובחנים מCD34+/cd38+ תאים. CMPs הם CD123lo/cd45ra-, gmps הם CD123lo/Cd45a+ ו meps הם CD123-/cd45ra-. מגרשים לפיזור מייצגים מניסוי מוצגים. (ב) אחוזי כולל של HSPCs (סה כ CD34+ תאים), cmps, gmps, ו-meps בדם טבורי מיוצגים. נתונים המוצגים הם ממוצעים עם שגיאה סטנדרטית משלושה ניסויים עצמאיים לפחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הניתוח האימונוophenic של תאים של השושלת המייאלואידית. תאים בודדים היו מגודרת על בסיס הצד הקדמי פיזור. CD34- תאים נבחרו על ידי צביעת עם נוגדן כדי CD34 (APC-Cy7). לינאיד מיאלואידית בCD34- האוכלוסייה נותחו עם נוגדנים ל-CD14 (pe), CD66B (Pe-Cy7), CD41 (percp-cy 5.5), ו CD235A (APC) ביום 1 (א) וביום 21 (ב). המונולוציטים הן CD14+/cdb-, גרנולוציטים הן CD14-/cdb+, מגקריוציטים הם CD41+/cd235a-ו- אריתרופוייד תאים הם CD41-/cd66b+. מגרשים לפיזור מייצגים מניסוי מוצגים. שברי מונוציטים, גרנולוציטים, מגקריוציטים, ותאי אריתרופואיד בCD34- אוכלוסיה ביום 1 ו -21 היום מיוצגים (C). נתונים המוצגים הם ממוצעים עם שגיאה סטנדרטית משלושה ניסויים עצמאיים לפחות. דמות זו השתנתה מתוך באפו ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : תמונות מייצגות של HSPCs ותאים הבדיל. CD34+ hspcs (A) ותאים מתרבויות מיאלואידים ביום 21 (ב) היו מוכתמים בכתם רייט-giemsa. תאים המתאימים לגרנולוציטים (חיצים שחורים), מונוציטים (חיצים כחולים) ותאי אריתרופואיד (חיצים אדומים) מוצגים. פסי קנה מידה מייצגים 10 מ"מ. דמות זו השתנתה מתוך באפו ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מתאים הבידול vivo לשעבר של UCB נגזר CD34+ hspcs לארבע לינאיד מיאלואידית. הדגירה הראשונית עם תערובת cy, המורכב SCF, TPO, Flt3L ו IL3 מעוררת CD34+ תאים. לאחר מכן, הבידול מושגת עם קוקטייל של SCF, IL3, Flt3L, אריתרופואיטין ו TPO. בתמהיל זה, SCF, IL3, ו-Flt3L חשובים להישרדות והתפשטות של CD34+ HSCS. אריתרופואיטין ו tpo לקדם הבדלה לקראת אריתרופוציטים ו-מגקריוציטים, בהתאמה, ו-IL3 מקדמת הבדלה של גרנולוציט מוקדם מונוציט סמנים מוקדמים ותאים בוגרים13,17,18. אזהרה אחת לשיטה זו היא הווריאציה הנצפתה באחוזים של תאים מובחנים. זה יכול להיות בגלל הבדלים בקיבולות של CD34+ hspcs מבודדים תורמים שונים כדי להצמיח את התאים שושלת היוחסין.

השכבה של התאים MS-5 היא קריטית לבידול יעיל של CD34+ hspcs. בניסיון שלנו, התאים MS-5 צריך להיות מצופה לפחות 24 שעות לפני זריעה של CD34+ תאים. חשוב לשמור על הזרימה של התאים MS-5 ב 80-90%. התאים MS-5 שוטפת נוטים להתנתק, ואת השטף התחתון גורם בידול מופחת. במהלך הדגירה, CD34+ תאים להתרחב על ידי ~ 50-קיפול. הם הופכים שוטפת ביום 14 ויש צורך לקצור ולפצל לבארות נוספות המכילות התאים MS-5 על צלחת חדשה.

תדירות השינויים במדיה היא קריטית גם לבידול יעיל ויש לבצע כל 3-4 ימים כדי לשמור על ריכוזי ציטוקין מיטביים. פחות שינויי מדיה וריכוזי ציטוקין הנמוכים, שניהם גורמים להפחתה בשגשוג ובבידול של CD34+ hspcs. דרישה זו עבור כמויות גדולות של ציטוקינים יכול להגדיל באופן משמעותי עלויות ולכן, היא הגבלה של פרוטוקול זה. מגבלה נוספת עבור ניסויים בקנה מידה גדול הוא מספר CD34+ תאים שהתקבלו מיחידה של דם טבורי. בדרך כלל, יחידת UCB טרייה של ~ 100 mL תשואות על 1,000,000 CD34+ תאים. אחסון היחידה מעבר ל -24 שעות מפחית באופן משמעותי את התשואה. אובדן נוסף של טוהר התאים CD34+ יכול להתרחש במהלך השלבים שטיפת העמודה החשובים להסרת כל תאים מזהם ללא תווית. אם העמודה מקבעת במהלך שלבי הכביסה, מומלץ שהתאים המאוגדים מתוך העמודה הסתומה יושבצו וייטענו מחדש בעמודה חדשה כדי לקבל אוכלוסיה טהורה של CD34+ תאים.

בספרות, שילובים שונים של ציטוקין דווחו כי לקדם את הבידול לעבר מגקריוציטוטיק, אריתרופואיד, או גרטונו-מונוציט19,20,21,22 . היתרון של פרוטוקול זה הוא שזה מאפשר בידול לאורך כל ארבעת האוכלוסיות מיאלואידית, כלומר מונוציטים, גרנולוציטים, מגקריוציטים, ו אריתרופוציטים. לפיכך, זה יכול להיות מועסק עבור לימוד הבחנה נורמלית מיאלואידית ולחקירת ההשפעה של מחלות מיאלואידית (תסמונות מיאלואידית, לוקמיה מיאלואידית חריפה, myeloproliferative ניפלאמים, ועוד) מוטציות נקודה משויכת טרנסמטיות כרומוזומלית על פנוטיפים מולקולריים וסלולאריים במהלך התפשטות ובידול של CD34+ תאים11,12,23,24,25. פרוטוקול זה יכול גם להיות מועסק לבדיקת ההשפעה של ציטוקינים אנטי ופרו דלקתיים, ועל תרופות טיפוליות פוטנציאליות על בידול מיאלואיד26,27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות וונדי בארט, רחל Caballero, וגבריאלה רואיז מחקלאות מערכות בריאות משולבות ליחידות דם טבורי מזוהה ותרם, Mrinalini קאלה לסיוע עם הזרימה cy, ו נוכלים גיי וכריסטופר Seet עבור עצה על בידול vivo מיאלואידית לשעבר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי כספים כדי אס מ המכונים הלאומיים לבריאות (R21CA170786 ו R01GM127464) והחברה האמריקנית לסרטן (מענק המחקר המוסדי 74-001-34-IRG). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan blue solution Thermo Fisher Scientific 15250-061 Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 Gibco  15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14185052 Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol red Thermo Fisher Scientific 15090046 Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filters Miltenyi biotech 130-041-407
35% sterile Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7979
7-AAD Biolegend 420404 Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) Biolegend 312207 Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) Biolegend 301403 Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) Biolegend 306012 Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) Biolegend 301806 Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) BD Biosciences 347543 Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) BD Biosciences 551336 Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) Biolegend 306609 Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) Biolegend 343514 Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) Biolegend 303506 Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) Biolegend 300405 Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) Biolegend 303720 Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) Biolegend 304126 Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) Biolegend 305116 Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) Biolegend 343103 Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine  Gibco 12100046 Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated Omega Scientific FB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit  Miltenyi biotech 130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research grade Miltenyi biotech 130-094-011 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 2 mM concentration in stimulation medium
LS Columns Miltenyi biotech 130-042-401
MACS Multi stand Miltenyi biotech 130-042-303
MidiMACS magnetic separator Miltenyi biotech 130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) GE Healthcare Biosciences 17-1440-03
MS-5 cells Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ml
Poly-L lysine Sigma-Aldrich P2636 Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) BioBasic RC213-15 Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) Takara  T100B Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) BioBasic RC214-16 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) BioBasic RC212-14 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) BioBasic RC213-12 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15) Lonza  04-418Q
Sodium bicarbonate Fisher Scientific BP328-500
Wright-Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich WG16-500 Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometer BD Biosciences
Centrifuge Sorvall Legend RT
Light microscope Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 150 CD34+ תאים בידול מיאלואידית גזע המטפאות ומחולל קדמון גרנולוציט מונוציט אריתרופואיטין מגקריוציט מחולל מיאלואידית משותף מחולל גרנולוייט מגקריוציט מחולל כדים
פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34<sup>+</sup> המטפאות גזע ותאים מחולל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bapat, A., Keita, N., Sharma, S.… More

Bapat, A., Keita, N., Sharma, S. Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (150), e59836, doi:10.3791/59836 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter