표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석
Summary
이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.
Abstract
종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.
Introduction
차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다2 . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는필요성입니다 3. 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.
전이는 전 세계적으로 암 관련 죽음의 90% 이상에 책임 있습니다5; 그러므로, 1 차및 전이성 병변 중 드라이버 유전자의 돌연변이 이질성을 포착하는 것은 고급 단계 질병을 위한 효과적인 치료의 디자인에 중요합니다. 임상 시퀀싱은 일반적으로 고정 된 조직에서 핵산에 수행, 때문에 가난한 DNA 품질의 게놈 전체 탐사 어려운 렌더링. 다른 한편으로는, 임상 순서의 의도는 주어진 치료 식이요법에 응답성/무반응을 예측할 수 있는 실행 가능한 돌연변이 및/또는 돌연변이를 확인하는 것입니다. 시퀀싱은 임상적으로 관련된 정보를 적시에 추출하기 위해 게놈의 작은 분획으로 제한될 수 있습니다. 낮은 처리량의 DNA 프로파일링(예: Sanger Sequencing)에서 NGS로의 전환은 수백 개의 암 관련 유전자를 높은 범위의 범위에서 분석할 수 있게 하여 종전 이벤트를 검출할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 동일 개별에게서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에 설명된 방법은 세 가지 잘 확립된 접근법(조직학적 분석, 고커버리지 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석)을 통합하여 확인된 변이의 기능적 결과를 예측합니다. 접근법은 도 1에 개략적으로 설명되고 췌장의 고체 가성 신생물(SPN)의 5가지 전이성 사례의 연구에 적용되었다. 우리는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 견본의 처리 그리고 분석을 기술하는 동안, 동일 절차는 신선한 동결 조직에서 유전 물질에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 결과는 이탈리아 암 게놈 프로젝트 (그랜트 번호)에 의해 지원되었습니다. FIRB RBAP10AHJB), 아소시아지오네 이탈리아나 리케르카 칸크로 (AIRC; 그랜트 번호 12182 에 AS 와 18178 VC), FP7 유럽 공동체 보조금 (캠 팩 No 602783 에 AS). 자금 조달 기관은 데이터의 수집, 분석 및 해석또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 않았다.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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