Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.
Organotipik, ya da dilim kültürler, yaygın in vitro işleyen merkezi sinir sisteminin yönlerini modellemek için istihdam edilmiştir. Nörolojide dilim kültürlerin potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu kullanarak çalışmalar hala kıt, özellikle insan deneklerin bu. Yetişkin insan dokusunun dilim kültürleri hazırlamak için kullanımı özellikle insan nöropatolojilerinin anlaşılmasını geliştirmek için çekicidir, çünkü kemirgenden (genellikle yenidoğan) üretilen dilimlerden yoksun olgun insan beyninin tipik benzersiz özelliklerine sahiptirler. sinir dokusu. Bu protokol, kısa süreli, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeksiyon beyin cerrahisi ne gönderilen yaşayan insan donörler toplanan beyin dokusu nasıl kullanılacağını açıklar. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler de sunulmaktadır. Temsili sonuçlar, tipik insan kortikal laminasyonunun 4 gün in vitro (DIV4) sonrasında, ana sinir hücre tiplerinin beklenen varlığıyla dilimler halinde korunduğunu göstermektedir. Ayrıca, DIV4’teki dilimler, bu modelin hücre ölümü tahlillerinde bir platform olarak hizmet etme potansiyelini gösteren, toksik bir uyarıcı (H2O2)ile meydan okunduğunda sağlam hücre ölümü geçirerek devam eder. Bu yöntem, membran kesici uçlar kullanarak yaygın olarak kullanılan protokole daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif, esas olarak yaşilişkili beyin hastalıklarının arkasındaki nörodejenerasyon mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan kısa süreli tahliller için tavsiye edilir. Son olarak, protokol farmakodirençli temporal lob epilepsisi cerrahisi tedavisine gönderilen hastalardan toplanan kortikal dokunun kullanılmasına ayrılmış olsa da, diğer beyin bölgelerinden/koşullardan toplanan dokunun da benzer serbest yüzen dilim kültürleri üretmek için kaynak olarak kabul edilir.
Araştırmada insan örneklerinin kullanımı kesinlikle insan beyin patolojileri çalışma için harika bir seçenektir, ve modern teknikler hasta kaynaklı doku kullanarak sağlam ve etik deney için yeni yollar açmıştır. Yetişkin insan beyninden hazırlanan organotipik/dilim kültürleri gibi yöntemler optogenetik1, elektrofizyoloji2,3,4,5, plastisite gibi paradigmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. 6,7,8,9, nörotoksisite / nörokoruma10,11,12,13, hücre tedavisi14, ilaç tarama15,16,17, genetik ve gen düzenleme12,18,19,20, diğerleri arasında, daha iyi bir strateji olarak yetişkinlik döneminde nörolojik hastalıkların anlaşılması.
İnsan beyin patolojilerinin altında yatan mekanizmaların kavrayışı, çok sayıda denek gerektiren deneysel stratejilere bağlıdır. Buna karşılık, dilim kültürleri söz konusu olduğunda, insan örneklerine erişim hala zor olsa da, tek bir kortikal örnekten 50 dilim emme olasılığı, birden fazla gönüllüyü toplanan doku başına kopya sayısı ve yapılan tahliller21.
Beyin organotipik / dilim kültürleri için çeşitli protokoller tarif edilmiştir, klasik oculo taslakları arasında değişen22,23 silindir tüp24,25,26, yarı geçirgen membranlar arayüzü27,28,29,30, ve serbest yüzen dilimler31,32. Deneysel bir tasarımın özelliklerine bağlı olarak, her tekniğin kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Yetişkin insan beyinlerinden kısa vadeli, serbest yüzen dilimler kültürleri bazı durumlarda Stoppini ve ark.27tarafından kullanılan yöntem üzerinde avantajlıdır , eğer in vitro uzun vadeli hücre sağkalım genellikle önemli bir endişe olduğu gerçeğini göz önünde bulundurursak bir kültür yöntemi, birçok deneyde kültürde sadece kısa süreler gereklidir12,31,32,33,34,35. Bu koşullar altında, serbest yüzen kültürlerin kullanımı daha basit ve daha uygun maliyetli olmanın avantajı nı sunar, hem de daha doğru 2-3 hafta boyunca kültürde tutulan dilimleri daha orijinal insan dokusu durumu andıran.
Dilim kültürlerin nörolojik potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu nu kullanan çalışmalar, özellikle insan deneklerinden hala çok azdır. Bu makalede, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeke beyin cerrahisi gönderilen yaşayan insan donörlerden toplanan beyin dokusu kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu protokol, yetişkinliğe bağlı nöropatolojilerin mekanizmaları üzerinde yapılan araştırmalarda canlılık ve nöronal fonksiyonuanaliz etmek için değerli olduğu kanıtlanmıştır.
Serbest yüzen, kısa süreli dilim kültürleri üretmek için bu protokol yetişkin insan neokortikal dilimleri kültüriçin alternatif bir yöntemdir. Dilim kültürleri için böyle bir protokol optogenetik1,44,45, elektrofizyoloji2,3,4,5 çalışmaları için uygun olabilir , kısa süreli plasti…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Doktora Sonrası Burs PNPD/INCT-HSM’den A.F.’ye ve N.D.M.’ye Doktora Öncesi Burs) ve FAEPA tarafından desteklenmiştir. G.M.A., FAPESP’den (MS 2018/06614-4) yüksek lisans bursuna sahiptir. N.G.C.’nin CNPq Araştırma Bursu’na sahibivar. Bu çalışma için rezeke edilen dokuları bağışlayan hastalara ve ailelerine teşekkür ederiz. Biz ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinik Hastanesi, São Paulo Üniversitesi, sürecin çeşitli aşamalarında yardımcı sakinleri, hemşireler, teknisyenler ve CIREP ekibinin desteğini kabul etmek istiyorum.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |