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方法文章

离体评估小鼠生殖道自发性运动的方法及基于MATLAB的子宫运动追踪算法用于数据分析

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DOI：

10.3791/59848

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2019年9月1日

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Anatomy, Cell Biology & Physiology, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

子宫收缩对女性健康至关重要。然而，病理性增强的收缩力可能导致痛经，尤其是在年轻女性中。本文介绍一种简单的离体实验方法，可用于快速评估平滑肌松弛剂治疗痛经的疗效。

摘要

痛经，即疼痛性痉挛，是女性月经期间最常见的症状，其严重程度可能影响女性的日常生活。本文介绍一种简便且经济的方法，可用于测试降低子宫收缩力的新药。该方法利用小鼠整个生殖道在体外培养于含氧 Krebs 缓冲液的培养皿中时可自发产生运动的独特特性。这种自发性运动类似于人类子宫肌层的波浪状活动，称为子宫内膜波。为验证该方法的有效性，我们使用了一种已知的子宫松弛药物——肾上腺素。结果表明，在该培养皿模型中，1 µM 肾上腺素可快速且可逆地抑制小鼠整个生殖道的自发性运动。记录子宫运动变化可通过普通智能手机或高精度数码相机轻松完成。我们开发了一种基于 MATLAB 的算法，通过测量子宫角运动频率来实现运动追踪，从而定量分析子宫自发性运动的变化。该体外方法的主要优势在于整个实验过程中生殖道保持完整，保留了所有固有的子宫内细胞相互作用。该方法的主要局限性在于，多达 10–20% 的子宫可能不表现出自发性运动。迄今为止，这是首个在培养皿模型中定量评估子宫自发性运动的 ex vivo 方法。

引言

作为女性的主要器官之一，子宫对生殖至关重要，并在胎儿发育过程中起着关键的营养供给作用1。子宫由三层结构组成：外膜层（perimetrium）、肌层（myometrium）和内膜层（endometrium）。肌层是子宫的主要收缩层，在胎儿娩出过程中发挥关键作用。内膜层是衬于子宫腔内的最内层结构，对胚胎着床至关重要。在未怀孕的育龄期女性中，内膜层每月于月经周期开始时脱落。肌层通过维持自发性收缩，协助完成这一脱落过程，从而将坏死的内膜组织从子宫中清除1。

遗憾的是，子宫肌层收缩力增强可能导致痛经等不良反应，即经期疼痛性痉挛。这种情况在年轻女性和未产妇中尤为常见2。然而，每位女性的痛经表现各不相同，其严重程度取决于子宫肌层收缩的强度；较强的收缩通常与剧烈痉挛感相关3。子宫肌层收缩力可通过子宫超声进行观察，常表现为子宫内膜波动。在子宫内膜脱落过程中，月经期前列腺素释放增加4，被认为会加剧子宫肌层的过度收缩，导致子宫肌肉缺血和缺氧，从而加重疼痛3。

严重的痛经可能影响部分女性的日常生活，有3%至33%的女性经历非常剧烈的疼痛，导致每次月经周期中有1至3天卧床不起5。无论年龄、国籍或经济状况如何，痛经是育龄女性妇科疾病中最主要的致病原因5。据估计，痛经的患病率既高且差异较大，在育龄女性中患病率范围为45%至93%5。  与痛经相关的疼痛会影响女性的日常生活，可能导致青少年学业表现下降、睡眠质量降低、日常活动受限以及情绪改变5。

许多患有严重痛经的女性会使用非处方药物来缓解疼痛。这类非处方药物含有环氧化酶（COX）抑制剂，可阻止前列腺素的形成6。然而，COX抑制剂与心血管不良事件相关，且约有18%的痛经女性对这些抑制剂无反应7。因此，亟需开发新的药物以减轻经期痉挛。由于子宫过度收缩参与了痛经的发病机制，一种可能的策略是使用子宫松弛剂。

量化潜在松弛药物在自然发生的子宫肌自发性波状收缩模型中的作用具有重要意义。然而，迄今为止，尚未有报道可用于完整子宫组织中测试肌肉松弛药物的高效离体方法。目前，通常采用等长张力测量法来评估松弛药物的效果。在此类测量中，将一段子宫肌条置于组织浴槽中，在预负荷条件下保持恒定长度，记录给予催产素刺激前后、在有或无松弛药物存在时子宫肌肉收缩的力量。尽管该方法非常有用，但需要昂贵的设备。此外，等长收缩并不能真实模拟完整子宫内自然发生的子宫肌自发性波状收缩。值得注意的是，在啮齿类动物中，当整个生殖道（包括卵巢、输卵管、子宫和阴道）被置于缓冲溶液中时，子宫肌层的波动可被直观地观察为子宫角的运动。本文介绍一种离体方法，用于监测置于含氧 Krebs 缓冲液的培养皿中的完整小鼠子宫的自发运动。同时，我们描述了一种利用 MATLAB 运动追踪器进行运动量化分析的算法。这一新方法为评估天然药物及合成化合物的松弛潜力提供了一种简便且成本较低的替代方案。

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方案

所有涉及动物的实验程序均已获得印第安纳大学医学院（印第安纳波利斯，印第安纳州）机构动物护理和使用委员会的批准。研究中使用了2至5月龄的F2-129S-C57BL/6性成熟雌性小鼠。

注意：在处理动物和生物危害性材料时，为确保安全，必须穿戴实验服、口罩和手套。

1. 溶液配制

  1. 配制含有以下成分的 Krebs 缓冲液：  130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.2 mM NaH2PO4、0.56 mM MgCl2、25 mM NaHCO3 和 5 mM 葡萄糖，pH 值为 7.4。使用含 5% CO2 和 95% O2 的压缩气体混合物持续对 Krebs 缓冲液进行氧合，并通过循环水浴将缓冲液温度维持在 37 °C。
  2. 配制 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS），其成分为：： 2.68 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、136.89 mM NaCl 和 8.1 mM Na2HPO4，pH 值为 7.4。

2. 动物准备

  1. 使用异氟烷（3%）吸入麻醉小鼠，并配备废气清除装置。通过评估缩足反射确保麻醉充分：夹捏后肢脚趾，确认无任何运动反应，表明反射反应已消失。达到深度麻醉后，通过断头法处死动物。 
    注意：异氟烷可能导致平滑肌舒张，因此在开始离体实验前，生殖道组织应充分冲洗，并在Krebs缓冲液中孵育至少15–30分钟。异氟烷接触皮肤时可能引起刺激或不适，操作时需谨慎。
  2. 将动物尸体置于铺有纸巾的大号称量皿上。 
    注意：怀孕的女性实验人员不应参与涉及异氟烷的实验，因其可能导致胎儿体重减轻、胎儿骨骼骨化减少，并增加自然流产的风险8,9。可采用CO2吸入法作为小鼠安乐死的替代方法。 

3. 动情周期阶段的确定

  1. 用小镊子轻轻提起阴蒂，暴露阴道口，然后将含有 10 µL DPBS 的微量移液器吸头缓慢插入阴道内。
    1. 确保移液器吸头以 10 - 30° 的角度通过阴道口插入，以避免刺穿阴道壁。插入后，吸头内的液体应仍可见。若液体不可见，则提示吸头插入过深，可能已穿破阴道的近宫颈区域。
    2. 用移液器吸头轻轻牵拉阴道口肌肉，使阴道内空气得以排出。
  2. 用 10 µL DPBS 缓慢吹打阴道腔 2–3 次，冲洗阴道，然后将收集的细胞悬液转移至载玻片上。
  3. 采用倒置相差显微镜通过细胞学分析判断动情周期所处阶段。操作步骤详见其他文献10,11。在进行细胞学分析前，应确保细胞悬液未干燥。必要时可用新鲜 DPBS 对悬液进行稀释。

4. 小鼠生殖道解剖

  1. 将小鼠置于仰卧位，并展开其四肢以暴露腹盆腔区域。
  2. 用70%乙醇喷洒，润湿并消毒腹盆腔区域。 
  3. 使用镊子小心提起位于阴蒂上方的皮肤。在下腹部两侧做小的横向切口，一直延伸至上肢部位，以暴露腹膜（图1A）。在此过程中会形成一个外侧皮瓣。随着不断进行小切口，该皮瓣将逐渐增大。
  4. 小心切开腹膜以暴露胃肠道（图1B）。需要注意的是，子宫角通常位于腹膜正下方，因此切口时应格外谨慎，避免触碰 子宫角，以免影响子宫的运动功能。
  5. 使用镊子去除覆盖在胃肠道上的筋膜和脂肪组织。从腹腔中取出以下胃肠道节段：十二指肠、空肠、回肠、盲肠、升结肠和横结肠（图1C）。
  6. 为定位生殖器官，首先识别膀胱（图1C，"4"），由于安乐死后排空，其可能呈塌陷状。阴道位于膀胱正下方。
  7. 在耻骨联合处（膀胱尾侧）定位两侧耻骨汇合的位置。
  8. 使用剪刀，通过小心地在耻骨联合两侧的耻骨间纤维软骨组织上做切口，切除耻骨联合，以便进入并建立阴道取出通道（图1D）。
  9. 切开位于肛门与外阴下部之间的会阴组织。
  10. 使用镊子提起阴道，并缓慢切除直肠。
  11. 在阴道头侧处识别两个分叉呈叉状的子宫角。在每个子宫角末端定位弯曲的输卵管和卵巢，它们可能被残留的胃肠道节段遮盖。使用小型解剖剪刀切除连接并支撑子宫角、输卵管和卵巢的任何韧带。
  12. 将包括阴道、子宫、输卵管和卵巢在内的整个生殖道从腹腔中取出。
  13. 将分离出的生殖道（图1E）转移至盛有10 mL DPBS的100 mm培养皿中。切勿压迫子宫角，以防损伤子宫肌层。
  14. 使用镊子和手术剪刀去除子宫角和阴道周围的所有结缔组织、脂肪组织，以及可能影响成像质量的耻骨区域毛发。切除阔韧带，以保证子宫角的运动能力。
  15. 用新鲜DPBS清洗分离的生殖道两次，然后将其转移至盛有3 mL充氧克雷布斯溶液的35 mm培养皿中。

5. 组织成像

  1. 将含有生殖道的培养皿置于含氧克雷布斯缓冲液中，并放在黑色表面上。保持培养皿在室温下。
    注意：可以使用红外加热垫将组织维持在 37 °C。
  2. 静置 15–30 分钟，待自发性收缩开始后，使用任意类型的数字视频设备从轴向平面记录子宫自发运动约 10 分钟。
  3. 将组织转移至另一个含有添加了待测化合物的含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中，使用任意类型的数字视频设备从轴向平面记录约 10 分钟的子宫自发运动。
  4. 用 10 mL DPBS 将整个生殖道在 100 mm 培养皿中清洗，以评估处理效应的可逆性。
  5. 将组织转移至含有新鲜含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中，使用任意类型的数字视频设备从轴向平面记录约 10 分钟的子宫自发运动。
  6. 将组织转移至另一盛有含待测化合物溶剂的 35 mm 培养皿中，以确保子宫自发运动未受机械因素影响。此为重要的对照步骤。
  7. 将视频资料转移至计算机硬盘中。

6. 数据分析

  1. 使用任意视频编辑软件，从包含对照、处理和清洗阶段的原始视频片段中制作视频剪辑。
  2. 使用 MATLAB 软件及提供的脚本（参见在线补充材料）来量化子宫的自发性运动活性。
    注意：必须安装 MATLAB 的 Computer Vision Toolbox 附加组件，脚本才能完全正常运行。
    1. 打开 MATLAB 脚本，进入编辑器选项卡，点击运行。
    2. 选择第一个视频文件，然后点击打开。
    3. 在弹出的对话框中输入该视频文件的标签，然后点击确定。
    4. 输入用于计算角部移动速率（Δ 欧几里得距离 / Δs）所需的时间间隔（s）。
    5. 使用鼠标光标在视频的第一帧上选择两个点。弹出窗口将提示确认所选点是否用于追踪。点击开始以启动实时追踪过程，该过程将在弹出窗口中显示。或者，点击重新选择点以重新选择两个点。
    6. 在弹出窗口中监控追踪过程的准确性。
    7. 在新的弹出窗口中观察速率-时间散点图和距离-时间散点图。通过在同一窗口中选择文件 | 另存为来保存这两个图像，以记录数据。
    8. 在 MATLAB 脚本所在目录中查找一个名为PointTrackerData的文件夹，该文件夹由 MATLAB 自动创建。找到一个名为label_Data的 Excel 文件，其中包含从视频中采集的数据点，分别位于两个独立的工作表标签页中。
      注意：可使用任何其他运动追踪软件来量化子宫的自发性运动活性。
  3. 使用适当的软件（例如 Excel 或 SigmaPlot 13）进行统计分析。

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结果

图1展示了本实验方案中所述整个生殖道分离过程的代表性图像。为避免毛发污染缓冲液而降低视频质量，我们使用70%乙醇润湿小鼠尸体。本方案解剖步骤的主要标志是找到膀胱。子宫和阴道位于膀胱的下方。

为了验证该方案，我们使用肾上腺素处理整个生殖道。肾上腺素是一种已知可引起子宫平滑肌松弛的物质。该激素由肾上腺髓质内源性产生，在哺乳动物中作为应激激素发挥作用。在实验中，我们使用了1 µM的肾上腺素，这是一个已知可产生最大反应的饱和浓度12。共进行了四组实验。在所有试验中，1 µM肾上腺素可逆性地抑制了子宫的自发性运动活性（图2）。

为了量化生殖道的自发性运动，我们设计了一种算法，用于评估小鼠生殖道上两个选定位置之间欧氏距离的平均变化速率。点位的追踪通过 MATLAB 软件的运动追踪模块实现。用于计算欧氏距离的相应 MATLAB 脚本已在在线补充材料

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讨论

本文介绍了一种评估整个啮齿类动物生殖道自发收缩功能的方法，该生殖道包括卵巢、输卵管、子宫角和阴道。我们曾采用类似方法证明了去氧肾上腺素对子宫自发运动的舒张作用13，但过去无法对数据进行定量分析。在本研究中，我们开发了一种基于MATLAB运动追踪模块的定量运动数据分析算法。该技术可用于检测调控子宫收缩功能的新药，无论这些药物是松弛还是收缩子宫平滑肌。该模型的主要优势在于生殖道结构保持完整，从而保留了所有固有的子宫内细胞相互作用。值得注意的是，本实验方案无需任何特殊设备。子宫的分离操作可通过简单的放大镜完成，且无需复杂的视频记录设备。若无高分辨率数码相机用于成像，也可使用个人手机摄像头作为替代。

评估生殖道运动功能方案中最关键的步骤是获取有活性的子宫组织。子宫角内的子宫肌层是生殖道中具有运动功能的部分。因此，在分离过程中应避免过度拉伸或挤压子宫角。在整个实验过程中，还需确保子宫组织充分供氧，以维持其收缩活性。防止子宫角受损的最佳方法是在清洗子宫或移动生殖道时，仅接触其周围的结缔组织。由于阴道在实验过程中不会自发收缩，因此在将生殖道从一个培...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由印第安纳大学内部资金资助。AGO 构思了该研究。XC 和 AGO 参与了所述实验的设计。  FL 和 AGO 对数据进行了分析和解释。KLL、JOB、FL 完成了所有实验 离体 实验。FL 编写了 MATLAB 脚本。KLL、JOB 和 AGO 撰写了手稿。  所有作者均阅读并批准了论文的最终版本。  

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸肾上腺素Sigma-Aldrich E4642 
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）Fisher Scientific 17-512Q
200 proof 乙醇Decon Laboratories2701
NaClSigma-AldrichS7653
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
KClSigma-AldrichP9333
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC5080
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
MgCl2  · 6H2OSigma-AldrichM9272
NaHCO3Sigma-AldrichS6297
异氟烷，USPPatterson Veterinary07-893-2374
解剖用超细尖精密镊子Fisher Scientific13-812-42
弯曲硬化精细虹膜剪Fine Science Tools14091-09
高性能模块化解剖体视显微镜Leica MZ6
带主动冷却系统的500万像素彩色数字显微相机Leica DFC425 C
Stereomaster 显微镜光纤光源Fisher Scientific 12-562-21
称量皿Fisher Scientific WB30304
Convertors Astound 标准外科手术服 Cardinal Health 9515小号、中号或大号
手套McKesson Corporation20-1080小号、中号或大号；无粉无菌乳胶或丁腈外科手套
 培养皿Corning Falcon351029100 mm
 培养皿Corning Falcon35300135 mm
95% O2-5% CO2 气体混合物Praxair MM OXCD5-K
耳挂式口罩Valumax International5430E-PP
2420万像素单反相机CanonEOS Rebel T6i
MATLABMathWorksN/A版本 2019 或更高

参考文献

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