فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

ملخص

هنا، يتم وصف فحص الأجسام المضادة الخالية في المختبر للتحليل المباشر لنشاط ميثيل ترانسفيراز على الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو في المختبر.

الملخص

هناك أكثر من 100 تعديلات متميزة كيميائيا من الحمض النووي الريبي، ثلثيها تتكون من ميثيلات. وقد ظهر الاهتمام بتعديلات الحمض النووي الريبي، وخاصة المثيلية، مرة أخرى بسبب الأدوار الهامة التي تقوم بها الإنزيمات التي تكتب وتمحوها في العمليات البيولوجية ذات الصلة بالمرض والسرطان. هنا، يتم توفير تحليل حساس في المختبر لتحليل دقيق لنشاط كاتب مثيلالحمض النووي الريبي على RNAs الاصطناعية أو في المختبر المنقولة. يستخدم هذا الاختبار شكل ثلاثي الجوانب من S-adenosyl-methionine، مما يؤدي إلى وضع العلامات المباشرة على الحمض النووي الريبي الميثيلي مع التريتيوم. الطاقة المنخفضة من إشعاع التريتيوم يجعل الأسلوب آمن، والأساليب الموجودة من قبل من تضخيم إشارة التريتيوم، تجعل من الممكن لتحديد وتصور الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، والتي هي عادة عرضة للقطع الأثرية. في حين أن هذه الطريقة مكتوبة لمثيلة الحمض النووي الريبي، عدد قليل من القرص جعله ينطبق على دراسة التعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى التي يمكن وصفها إشعاعيا، مثل أسيتيل الحمض النووي الريبي مع ¹⁴C أسيتيل الإنزيم A. عموما، وهذا الفحص يسمح لتقييم بسرعة RNA شروط المثيلة، تثبيط مع مثبطات جزيء صغير، أو تأثير RNA أو متحولة الإنزيم، ويوفر أداة قوية للتحقق من صحة وتوسيع النتائج التي تم الحصول عليها في الخلايا.

المقدمة

الحمض النووي، الحمض النووي الريبي والبروتينات تخضع للتعديلات التي تنظم بإحكام التعبير الجيني¹. ومن بين هذه التعديلات، تحدث المثيلة على جميع البوليمرات الحيوية الثلاثة. وقد تم دراسة الحمض النووي والبروتين الميثيل بشكل جيد جدا خلال العقود الثلاثة الماضية. وعلى النقيض من ذلك، لم يتجدد الاهتمام بمثيلة الحمض النووي الريبي إلا مؤخراً في ضوءالأدوار الهامة التي تلعبها البروتينات التي تكتب أو تمحو أو تربط المثيلة في التنمية والمرض 2. بالإضافة إلى وظائف معروفة في ribosomal وفيرة ونقل RNAs، مسارات مثيلة RNA تنظيم محددة رسول RNA الاستقرار^3،4، الربط⁵ و....

البروتوكول

1. في المختبر النسخ وتنقية هلام من RNA الهدف

1. استنساخ تسلسل الاهتمام في بلازميدات تحتوي على T7 و /أو SP6 المروجين باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي المعمول بها¹² أو مجموعات.
2. خطية قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر
   1. تضخيم تسلسل الاهتمام من قبل PCR من بلازميد مع التمهيديات المصممة لتشمل منطقة المروج T7 من خلال إدراج، +20-30 bp المنبع والمصب كما سبق وصفه¹³.
   2. بدلا ً من ذلك، هضم 5 ميكروغرام من بلازميد باستخدام أنزيم تقييدي (RE) قطع الموقع متاح المصب إدراج وفقا للتعليمات المقدمة من المورد من RE.
      ملاحظة: تذكر للتحقق المزدوج من عدم قطع الإدراج بواسطة RE المحدد. اختيار RE ....

النتائج

رد فعل النسخ في المختبر
الشكل 2 يمثّل [ا] شوط نموذجيّة من [إينترو فيترو] نسخ ردّ فعل مع ال [ت7] [رنا] [بولمرس] من ال [7سك] [سنرنا], أيّ يكون نسبيّا قصيرة (331 [نت]) وجدّا ينظّم [رنا]. كما هو مبين في تلك الصورة الخام، هناك العديد من العصابات غير المرغوب فيها، على حد سواء أقصر وأطول من 7SK، وربما الناجمة عن بدء النسخ العشوائي أو أحداث الإنهاء. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر من المهم الحصول على عينة RNA نظيفة كما هو مبين في

المناقشة

هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز نحو نسخ محددة. ويستفيد الفحص من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن يكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذا التقييم لا يمكن أن تشير إلى أي بقايا أو مجموعة كيميائية هو ميثيلات من قبل الإنزيم. ولتحديد أو التحقق من أن بقايا معينة قد طُرِّمت، يمكن استخدام أساليب أخرى مثل تحليل الطفرات.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10 نقطة أساس سلم الحمض النووي	Invitrogen	10821-015	10 نقطة أساس DNA سلم كيت.
10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)   ؛	N / A	N / A	لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (ل 10 مل ، قم بإذابة 1 جم في 8 مل من ماء مللي كيو ؛ اضبط الحجم على 10 مل بماء مللي كيو ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام حقنة 10 مل مجهزة ب 0.45 & micro ؛ مرشح م).
10X TBE Buffer	N / A	N / A	لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (لمدة 1 لتر ، أضف 108 جم من Tris Base ، و 55 جم من حمض البوريك إلى أسطوانة مع شريط تحريك ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركه يذوب ؛ أضف 40 مل من 0.5 M Na2EDTA (درجة الحموضة 8.0) ؛ اضبط الحجم إلى 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م).
10 × تيرابايت	N / A	N / A	للحصول على 1 لتر ، أضف 60.5 جم من Tris Base ، و 87.6 جم من كلوريد الصوديوم إلى أسطوانة بقضيب تقليب ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركها تذوب ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز ؛ اضبط الحجم على 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م.
أكريلاميد: Bis-Acrylamide 29: 1 (40٪ محلول / الرحلان الكهربائي) ، Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.
أدينوسيل-ل-ميثيونين, S- [ميثيل-3H]; (سام [3 ح])	بيركين إلمر	NET155V250UC	لمثيلة الحمض النووي الريبي في المختبر ؛ التركيز = 1.0 ملي Ci / مل ؛ نشاط محدد = 17.1 Ci / mmol ؛ المولارية = (1.0 Ci / L) / (83.2 Ci / mmol) = 0.0584 مليمول / لتر = 58.4 µ ؛ M.   ؛   عند استلام أنبوب 3H-SAM المجمد ، قم بإذابة الثلج عند 4 درجات ؛ C ، جعل 20 & micro ؛ L aliquots ، وتجميدها عند -30 درجة مئوية. لا تقم أبدا بإعادة تجميد وإعادة استخدام حصة مستخدمة جزئيا.
أمرشام هايبر كاسيت التصوير الشعاعي الذاتي كاسيت	GE Healthcare	RPN11649	للتعرض لهلام الأشعة الذاتية.
Amersham Hyperfilm MP		Healthcare 28906846	للتعرض لجل التصويري الذاتي.
عداد الوميض	بيكمان	LS6500	لعدد التلألؤ السائل.
نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير Biorad	Biorad	1704466	نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير.
أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من EDTA	Roche Applied Science	4693159001	للحصول على محلول 20X ، قم بإذابة قرص واحد في 0.525 مل من الماء الخالي من النوكلياز.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase كاسيت فارغ مجاني لهلام بولي أكريلاميد.
معيار الكاسيت الفارغة	Biorad	1656001	خلية الرحلان الكهربائي العمودي بتنسيق متوسط.
الطيف الضوئي DeNovix DS-11 مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغير	DeNovix	DS-11-S	لقياس تركيز الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	لعدد التلألؤ السائل.
قوارير فيشربراند 7 مل HDPE تلألؤ	فيشر	03-337-1	لعدد التلألؤ السائل.
محسن التصوير الشعاعي الذاتي سريع المفعول Fluoro-Hance	RPI CORP	112600	للمعالجة المسبقة لهلام الأشعة الذاتية.
جل مجفف	Biorad	1651745	لتجفيف الجل.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	لتحميل الحمض النووي الريبي في تغيير طبيعة هلام اليوريا بولي أكريلاميد (التركيب: 95٪ فورماميد ، 18 ملي مولار EDTA ، و 0.025٪ SDS ، زيلين سيانول ، وبروموفينول أزرق).
نصائح استئصال الجل القابل للتصرف GeneCatcher	شركة Gel	NC9431993	لإزالة العصابات من المواد الهلامية الاغاروز والبولي أكريلاميد.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	للنسخ في المختبر مع T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (شفاف) / NC9965364 (أسود)	صندوق تلطيخ جل.
pRZ	Addgene	# 27663	البلازميد لإنتاج نصوص في المختبر بنهايات متجانسة
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	لتنظيف الحمض النووي الريبي ، استخدم البروتوكول المعدل الوارد في البروتوكول.
طقم استخراج جل QIAquick (50)	مجموعة Qiagen	28704	لاستخراج الجل وتنظيف جزء dsDNA المستخدم في النسخ في المختبر.
ساران بريميوم بلاستيك التفاف	ساران	راب أمازون	لتجفيف الجل.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	صبغة هلام الحمض النووي فائقة الحساسية.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	صبغة هلام الحمض النووي.
TE	Sigma	93283-100ML	10 ملي Tris-HCl ، 1 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA ، درجة الحموضة 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.
خلاط حراري مع أنابيب SMARTBLOCK 24X 1.5 مل	eppendorf	5382000023 / 5361000038	لحضانة أنابيب 1.5 مل للتحكم في درجة الحرارة.
تقنيات		الحياة لمجموعة الاستنساخ TOPO TA	للاستنساخ السريع ل Taq polymerase & ndash ؛ تضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نواقل تحتوي على محفزات T7 و / أو SP6 لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر.
TURBO DNase (2 U & frasl ؛ ومايكرو. L)	Ambion	AM2238	لإزالة الحمض النووي من تفاعلات النسخ في المختبر.
اليوريا	سيجما	51456-500 جرام	لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا.
ورق Whatman 3MM	GE Healthcare	3030-154	ورق كروماتوغرافيا لتجفيف الجل.

GE من مقياس مجموعات