JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Published: October 16, 2019
doi:
10.3791/59859
,
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science,RIKEN, 2Senior Adviser’s Office, Center for Brain Science,RIKEN

Summary

I nogle genmanipulerede dyr, ved hjælp af en enkelt protokol kan undlade at fremkalde LTD i cerebellar Purkinje celler, og der kan være en uoverensstemmelse mellem LTD og motor læring. Flere protokoller er nødvendige for at vurdere LTD-induktion i genmanipulerede dyr. Standard protokoller vises.

Abstract

Synaptic plasticitet giver en mekanisme til indlæring og hukommelse. For cerebellar motorisk indlæring betragtes langtids depression (LTD) af synaptiske transmissioner fra parallelle fibre (PF) til Purkinje celler (PC) som grundlag for motorisk indlæring, og der observeres mangler ved både LTD og motorisk indlæring i forskellige genmanipulerede dyr. Fælles motorisk lærings sæt, såsom tilpasning af optokinetisk refleks (OKR), vestibulær-okulær refleks (VOR), og rotarod test blev anvendt til evaluering af motorisk indlæringsevne. Men, resultater opnået fra GluA2-carboxy Terminus modificeret Knock-in mus viste normal tilpasning af VOR og OKR, trods mangler PF-LTD. I denne rapport, induktion af LTD blev kun forsøgt ved hjælp af en type af stimulation protokol ved stuetemperatur. Således, betingelser for at inducere cerebellar LTD blev udforsket i samme Knock-in mutanter ved hjælp af forskellige protokoller på nær fysiologiske temperatur. Endelig fandt vi stimulation protokoller, som LTD kunne blive induceret i disse genmanipulerede mus. I denne undersøgelse foreslås en række protokoller til at evaluere LTD-induktion, som vil mere præcist tillade undersøgelse af årsagssammenhæng mellem LTD og motor læring. Afslutningsvis, eksperimentelle betingelser er afgørende, når du evaluerer LTD i genmanipulerede mus.

Introduction

Den synaptiske organisation af de udarbejdede neuronal netværk af cerebellare cortex, sammensat af pc’er, molekylært lag interneuroner (kurv og stellate celler), Golgi celler, PFs fra granulet celler, Mossy fibre og klatring fibre (CFs), er blevet belyst med hensyn til excitation/hæmning og divergens/konvergens, og den velorganiseret kredsløb diagram har antydet, at cerebellum er en “neuronal maskine”1, selv om der var tidligere ingen idé om formålet med denne “maskine”. Senere foreslog Marr, at PFs-input til pc’er udgør et tredobbelt lags associativ lærings netværk2. Han foreslog også, at hver CF formidler en cerebral instruktion for elementær bevægelse2. Han antog, at samtidig aktivering af PFs og CF ville forbedre PF-PC synapse aktivitet, og forårsage langsigtede potensering (LTP) af PF-PC synapse. På den anden side antog Albus, at synkrone aktivering af PFs og CF resulterede i Ltd på PF-PC synapser3. Begge de ovennævnte undersøgelser fortolker cerebellum som en unik hukommelse enhed, inkorporering af som i cerebellare kortikale netværk fører til dannelsen af Marr-Albus model lærings maskine model.

Efter disse teoretiske forudsigelser, to linjer af beviser tyder på tilstedeværelsen af synaptisk plasticitet i cerebellum. Den første linje af beviser blev foreslået af den anatomiske organisation af flocculus; Her er MF-veje med vestibulær organ oprindelse og CF-veje af retinal oprindelse konvergerer på pc’erne4. Denne unikke konvergens mønster tyder på, at en synaptisk plasticitet forekommer i flocculus forårsager den bemærkelsesværdige tilpasningsevne af vestibulo-okulær refleks. For det andet, optagelsen af pc’er svar i flocculus og lesioning af flocculus også støttet ovenstående hypotese5,6,7. Desuden, PC udledning mønster under tilpasningen af en abe håndbevægelse8 støttede den synaptiske plasticitet hypotese, især ALBUS Ltd-hypotese3.

For at bestemme arten af den synaptiske plasticitet direkte, gentagen konjunktiv stimulation (CJS) af et bundt af PFs og CF, der specifikt innervates PC in vivo viste sig at inducere Ltd for transmissionseffekten af PF-PC synapser9, 10,11. I de efterfølgende in vitro-udforskninger ved hjælp af en cerebellar skive12 og dyrkede pc’er, sammenholdt med co-dyrkede granulet celle stimulation og oliven celle stimulation13 eller sammenhæng af iontophoretisk anvendt glutamat og somatisk depolarisering14,15 forårsagede Ltd. Den signal transduktionsmekanisme, som lå til grund for Ltd-induktion, blev også intensivt undersøgt med in vitro-præparater16,17.

Tilpasninger af VOR og OKR blev ofte brugt til kvantitativ evaluering af genmanipulerende virkninger på cerebellare motorisk indlæring, fordi vestibule-cerebellare cortex blev vist sig at være den essentielle oprindelse i den adaptive læring af VOR18 ,19,20 og okr19,21 sammenhængen mellem svigt af Ltd-induktion og svækkelse af adfærdsmæssige motorisk indlæring er blevet taget som bevis for, at Ltd spiller en væsentlig rolle i motor lærings mekanismer22. Disse synspunkter betegnes kollektivt som Ltd-hypotesen om motor læring eller Marr-Albus-Ito-hypotesen23,24,25,26.

Adaptiv indlæring af øjenbevægelser blev målt ved hjælp af lignende protokoller, mens forskellige eksperimentelle betingelser blev anvendt til at inducere Ltd i Skive tilberedning27,28,29,30,31 . For nylig rapporterede Schonewille et al.26 , at nogle genmanipulerede mus udviste normal motorisk indlæring, men de cerebellare skiver viste ikke Ltd, og konkluderede dermed, at Ltd ikke var afgørende for motorisk indlæring. Imidlertid blev induktion af LTD kun forsøgt ved hjælp af en type protokol ved stuetemperatur. Derfor brugte vi flere typer af LTD-inducerende protokoller under optagelses forhold på omkring 30 °C, og vi bekræftede, at LTD blev pålideligt induceret i de genmanipulerede mus ved hjælp af disse protokoller ved nær fysiologiske temperaturer32.

Der er dog stadig nogle spørgsmål vedrørende de grundlæggende egenskaber af konjunktiv stimulation. Den første er forholdet mellem den komplekse Spike form og amplituden af LTD. For det andet, sammenholdt med PF-stimulation og somatisk depolarisering, om antallet af anvendte stimuli var nødvendige eller ikke var undvigende. I denne undersøgelse blev disse spørgsmål undersøgt ved hjælp af Wild type (WT) mus.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af RIKEN-Udvalget om pasning og anvendelse af dyr til forsøg. Mus blev holdt i dyret facilitet af RIKEN Center for hjernen videnskab under velkontrolleret temperatur (23 – 25 °C) og fugtighed (45% – 65%) Betingelser. Både mænd og kvinder WT mus (C57BL/6, 3 – 6 måneder) blev anvendt. 1. forberedelse af de løsninger, der anvendes i forsøgene Bemærk: Alle opløsninger bør fremstilles i ultrarent vand u…

Representative Results

Fire protokoller blev anvendt i dette studie til at inducere cerebellar LTD. I de to første protokoller (protokol 1 og 2) blev der anvendt en kombination af PF-stimulation og CF-stimulation under de nuværende klemmer forhold. I de to andre protokoller (protokol 3 og 4) blev den somatiske depolarisering erstattet af CF-stimulation under spænding-klemme forhold. Spændings spor eller strøm spor under konjunktiv stimulation blev sammenlignet (figur 2). Kombinatio…

Discussion

Forskelle mellem de fire protokoller

I LTD-inducerende protokoller 1 og 2, CJS 300 gange ved 1 Hz er tilstrækkelig til at inducere cerebellar LTD. stimulation hyppigheden af CF syntes at være i et fysiologisk område, fordi den komplekse Spike fyring sats i Alert voksne mus (P60) blev rapporteret til at være 1,25 Hz36. CF-stimulationen alene forårsagede imidlertid ikke langvarig plasticitet i PF-CF-synapse som anvendt i protokol 1 og 2 (figur 4</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker A. Oba for hendes tekniske assistance. Denne forskning blev delvis støttet af støtte til videnskabelig forskning (C) 17K01982 til K.Y.

Materials

Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. . The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Keywords: LTD InductionCerebellar SlicesGene ManipulationMotor LearningACSFTetrodotoxinBrain DissectionPurkinje CellsCerebellum SlicingCutting ACSFOxygen-carbon Dioxide Gas
check_url/59859?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image