Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos
Summary
En algunos animales manipulados por genes, el uso de un solo protocolo puede no inducir LTD en células de Purkinje cerebelosas, y puede haber una discrepancia entre LTD y el aprendizaje motor. Se utilizan varios protocolos para evaluar la inducción LTD en animales manipulados genéticamente. Se muestran los protocolos estándar.
Abstract
La plasticidad sináptica proporciona un mecanismo para el aprendizaje y la memoria. Para el aprendizaje motor cerebeloso, la depresión a largo plazo (LTD) de las transmisiones sinápticas de fibras paralelas (PF) a células Purkinje (PC) se considera la base para el aprendizaje motor, y las deficiencias de LTD y el aprendizaje motor se observan en varios animales manipulados por genes genéticos. Se utilizaron conjuntos comunes de aprendizaje motor, como la adaptación del reflejo optocinético (OKR), el reflejo vestibular-ocular (VOR) y la prueba de rotarod para evaluar la capacidad de aprendizaje motor. Sin embargo, los resultados obtenidos de los ratones knock-in modificados de GluA2-carboxy demostraron una adaptación normal del VOR y el OKR, a pesar de la falta de PF-LTD. En ese informe, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo de estimulación a temperatura ambiente. Por lo tanto, las condiciones para inducir a LTD cerebeloso fueron exploradas en los mismos mutantes knock-in usando varios protocolos a temperatura casi fisiológica. Finalmente, encontramos protocolos de estimulación, por los cuales LTD podría ser inducido en estos ratones manipulados genéticamente. En este estudio, se propone un conjunto de protocolos para evaluar la inducción LTD, que permitirá con mayor precisión el examen de la relación causal entre LTD y el aprendizaje motor. En conclusión, las condiciones experimentales son cruciales a la hora de evaluar LTD en ratones manipulados por genes.
Introduction
La organización sináptica de las redes neuronales elaboradas de la corteza cerebelosa, compuesta por PC, interneuronas de capa molecular (células de cesta y células estelares), células Golgi, PFs de células gráulas, fibras musgosas y fibras de escalada (CF), se han aclarado en términos de excitación/inhibición y divergencia/convergencia, y el diagrama de circuitos bien organizados ha sugerido que el cerebelo es una “máquina neuronal”1, aunque anteriormente no había idea sobre el propósito de esta “máquina”. Más tarde Marr propuso que la entrada de PFs a los PC constituya una red de aprendizaje asociativo de triple capa2. También sugirió que cada CF transmitiera una instrucción cerebral para el movimiento elemental2. Asumió que la activación simultánea de los PF y el CF mejoraría la actividad de la sinapsis PF-PC y causaría la potenciación a largo plazo (LTP) de la sinapsis PF-PC. Por otro lado, Albus asumió que la activación síncrona de los PF y CF dio lugar a LTD en las sinapsis PF-PC3. Ambos estudios anteriores interpretan el cerebelo como un dispositivo de memoria único, la incorporación de los cuales en la red cortical cerebelosa conduce a la formación del modelo de máquina de aprendizaje Marr-Albus.
Después de estas predicciones teóricas, dos líneas de evidencia sugieren la presencia de plasticidad sináptica en el cerebelo. La primera línea de evidencia fue sugerida por la organización anatómica del floculus; aquí las vías MF de origen orgánico vestibular y las vías CF de origen retiniano convergen en los PC4. Este patrón de convergencia único sugiere que una plasticidad sináptica que ocurre en el floculus causa la notable adaptabilidad del reflejo vestibulo-ocular. En segundo lugar, el registro de la respuesta de los PC en el floculus y la lesión del floculus también apoyó la hipótesis anterior5,6,7. Además, el patrón de descarga de PC durante la adaptación del movimiento de la mano de un mono8 apoyó la hipótesis de plasticidad sináptica, especialmente la hipótesis LTD de Albus3.
Para determinar la naturaleza de la plasticidad sináptica directamente, se demostró que la estimulación conjuntiva repetida (Cjs) de un haz de Pf sFs y el CF que inerva específicamente el PC in vivo induce a LTD para la eficacia de transmisión de las sinapsis PF-PC9, 10,11. En las exploraciones in vitro posteriores utilizando una rebanada cerebelosa12 y PC cultivadas, la conjunción de estimulación de células de gránulos cocultivadas y estimulación de células de olivo13 o la conjunción de glutamato aplicado iontoforéticamente y somático despolarización14,15 causó LTD. El mecanismo de transducción de señales subyacente a la inducción LTD también se investigó intensivamente utilizando los preparados in vitro16,17.
Las adaptaciones del VOR y el OKR se utilizaron a menudo para la evaluación cuantitativa de los efectos de manipulación genética en el aprendizaje motor cerebeloso, porque se demostró que la corteza de vestibulo-cerebelosa era el origen esencial en el aprendizaje adaptativo del VOR18 ,19,20 y el OKR19,21 La correlación entre el fracaso de la inducción LTD y el deterioro del aprendizaje motor conductual se ha tomado como evidencia de que LTD desempeña un papel esencial en el motor mecanismos de aprendizaje22. Estas vistas se conocen colectivamente como la hipótesis LTD del aprendizaje motor, o la hipótesis De Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
El aprendizaje adaptativo del movimiento ocular se midió utilizando protocolos similares, mientras que se utilizaron varias condiciones experimentales para inducir LTD en la preparación de rodajas27,28,29,30,31 . Recientemente, Schonewille y otros26 informaron que algunos ratones manipulados genéticamente demostraron un aprendizaje motor normal, pero las rodajas cerebelosas no mostraron LTD, y por lo que concluyeron que LTD no era esencial para el aprendizaje motor. Sin embargo, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo a temperatura ambiente. Por lo tanto, utilizamos varios tipos de protocolos inducidores de LTD en condiciones de registro a alrededor de 30 oC, y confirmamos que el LTD fue inducido de forma fiable en los ratones manipulados por genes mediante el uso de estos protocolos a temperaturas casi fisiológicas32.
Sin embargo, quedan algunas preguntas con respecto a las propiedades básicas de la estimulación conjuntiva. La primera es la relación entre la forma del pico complejo y la amplitud de LTD. En segundo lugar, junto con la estimulación de la PF y la despolarización somática, si el número de estímulos utilizados era necesario o no era esquiva. En el presente estudio, estas preguntas se investigaron utilizando ratones de tipo salvaje (WT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferencias entre los cuatro protocolos
En los protocolos de inducción LTD 1 y 2, Cjs 300 veces a 1 Hz es suficiente para inducir la frecuencia de estimulación cerebelosa LTD. Sin embargo, la estimulación CF por sí sola no causó plasticidad a largo plazo en la sinapsis PF-CF, tal como se utiliza en los protocolos 1 y 2(Figura 4, Figura 5), aunque la estimulación CF sola a mayor frecuencia inducida LTD<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a A. Oba por su asistencia técnica. Esta investigación fue parcialmente apoyada por Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.
Materials
| Amplifier | Molecular Devices-Axon | Multiclamp 700B | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | BF150-110-10 | |
| Digitizer | Molecular Devices-Axon | Digidata1322A | |
| Electrode puller | Sutter | Model P-97 | |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 26675-46-7 | |
| Isolator | A.M.P.I. | ISOflex | |
| Linear slicer | Dosaka EM | PRO7N | |
| Microscope | NIKON | Eclipse E600FN | |
| Peristaltic pump | Gilson | MP1 Single Channel Pump | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Pure water maker | Merck-Millipore | MilliQ 7000 | |
| Software for experiment | Molecular probe-Axon | pClamp 10 | |
| Software for statistics | KyensLab | KyPlot 5.0 | |
| Stimulator | WPI | DS8000 | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 1078 |
References
- Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. . The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).
- Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
- Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
- Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
- Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
- Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
- Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
- Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
- Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
- Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
- Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
- Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
- Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
- Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
- Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
- Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
- Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
- Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
- van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
- Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
- De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
- Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
- Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
- Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
- Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
- Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
- Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
- Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
- Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
- De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
- Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
- Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
- Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
- Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
- Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
- Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
- Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
- Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
- Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
- Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
- Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).
