Summary
Biologisk membran fusjon er katalysert av spesialiserte fusjons proteiner. Måle fusogenic egenskaper av proteiner kan oppnås ved lipid miksing analyser. Vi presenterer en metode for rensing av rekombinant Drosophila atlastin, et protein som formidler homotypic fusjon av AKUTTEN, rekonstituering av det til preformed liposomer, og testing for fusjons kapasitet.
Abstract
Membran fusjon er en viktig prosess i den eukaryote cellen. Spesialiserte proteiner er nødvendig for å katalysere fusjon. Atlastins er endoplasmatiske retikulum (er) bosatt proteiner innblandet i homotypic fusjon av AKUTTEN. Vi detalj her en metode for rensing en glutation S-glutamyltransferase (GST) og Poly-histidin merket Drosophila atlastin av to runder av affinitet kromatografi. Studere Fusion reaksjoner in vitro krever renset Fusion proteiner som skal settes inn i en lipid bilayer. Liposomer er ideelle modell membraner, som lipid sammensetning og størrelse kan justeres. For dette formålet beskriver vi en metode for rekonstituering ved rengjøringsmiddel fjerning for Drosophila atlastin til preformed liposomer. Selv om flere metoder for rekonstituering er tilgjengelige, har fjerning av vaskemiddel flere fordeler som gjør den egnet for atlastins og andre lignende proteiner. Fordelen med denne metoden inkluderer en høy rekonstituering yield og riktig orientering av rekonstituert protein. Denne metoden kan utvides til andre membran proteiner og for andre programmer som krever proteoliposomes. I tillegg beskriver vi et bånd basert lipid miksing analysen av proteoliposomes brukes som en måling av membran fusjon.
Introduction
Membran fusjon er en kritisk prosess i mange biologiske reaksjoner. Under biologiske forhold er membran fusjon ikke spontan og krever spesialiserte fusjons proteiner for å katalysere slike reaksjoner1. Er homotypic membran Fusion er mediert i dyr av dynamin relaterte GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypic fusjon er grunnleggende for treveis kryss i perifer er, som utgjør et stort sammenhengende nettverk av tubuli som strekker seg over hele cellen. Atlastins har en bevart domene morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt midtre domene, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-terminal hale3. In vitro studier med rekombinant Drosophila atlastin har vist at når rekonstituert til liposomer, opprettholder den sine fusogenic egenskaper. Andre atlastins, inkludert menneskelige homologs har ikke vært i stand til å recapitulate fusjon in vitro. Vi beskriver her en metodikk for rensing en GST og Poly-histidin merket rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituering av det til liposomer, og assaying fusjon.
Studere membran Fusion in vitro presenterer en utfordring som fusogenic proteiner har vanligvis en membran anker. For å studere dem, er det nødvendig å Rekonstituer dem inn i modellen lipid bilayers. Store unilamellære blemmer (LUV) er et nyttig verktøy for å studere lipid protein interaksjoner. Vi presenterer her et system for å gjøre elsker av forskjellige lipid komposisjoner for protein rekonstituering og fusjon analyser. Rekonstituering av Integral proteiner i har kan oppnås ved en rekke metoder, inkludert, organiske løsemiddel-mediert rekonstituering, mekaniske mekanismer, eller vaskemiddel assistert rekonstituering4. Vi presenterer her en metode for rekonstituering av Drosophila atlastin inn preformed liposomer av vaskemiddel fjerning. Fordelene med denne rekonstituering metoden inkluderer høy rekonstituering gir og riktig orientering av atlastin i lipid bilayer. I tillegg, gjennom denne metoden, er proteinet ikke tørket eller utsatt for organiske løsemidler og dermed opprettholde struktur og funksjon. Blant sine ulemper, tilstedeværelsen av vaskemidler kan ikke være ideelt for alle proteiner og den endelige proteoliposomes kan ha noen innarbeidet vaskemiddel i lipid bilayer. Ytterligere dialyse kan brukes til å eliminere mer av vaskemiddel. Men dialyse kan ta lang tid og kan derfor føre til tap av protein aktivitet.
Vurdering atlastin ' s Fusion aktivitet kan bestemmes av lipid miksing analyser som tidligere beskrevet2. Her, vi avgrense en metode for å måle atlastin mediert fusjon gjennom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-YL (neste arbeidsdag)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) merket lipider. Denne analysen krever fusjon av donor (merket) proteoliposomes og Acceptor (umerkede) proteoliposomes. En bånd Release kan måles under reaksjonen som fortynning av en giver-Acceptor par fra "merket" liposomer til "umerkede" liposomer som et resultat av lipid miksing under membran fusjon (figur 1)5. Mens denne analysen fungerer som en proxy for membran fusjon, er det begrenset i skille mellom membran fusjon og hemifusion, en tilstand der bare de ytre brosjyrer mix. For å løse dette problemet, er et alternativ ytre pakningsvedlegget slukker av neste arbeidsdag ved dithionite. Etter den samme metodikk som neste arbeidsdag/rhodamine lipid blande analyser, ved å slukke den ytre pakningsvedlegget noen arbeidsdag bånd utgivelse ved fusjon vil være på grunn av indre pakningsvedlegg blanding8.
Alternative fusjon analyser av indre vandig innhold miksing adresse full fusjon bare5. Eksempler på dette er Terbium (TB)/dipicolinic acid (DPA) analyser og aminonaphthalene trisulfonic acid (ANTS)/p-xylene BIS (pyridinium) bromide (DPX) analyser. I TB/DPA-analyser blir en pool av liposomer med innkapslet TB blandet og smeltet sammen med liposomer med innkapslet DPA. ved fusjon økes fluorescens via intern energi overføring fra DPA til TB i [TB (DPA)3]3- Chelation Complex6. Til sammenligning, for ANTS/DPX-analyser, er ANTS-fluorescens slukket av DPX7. Selv om disse systemene adresserer blanding av indre innhold, er det nødvendig med mer dybde utarbeidelse av liposomer for fjerning av ikke-innkapslet reagenser, i tillegg til utilsiktet interaksjon av fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. rensing av GST-DAtl-His8
-
Protein uttrykk og lysat forberedelse
- Transformer BL21 (DE3) E. coli med GST-DAtl-His8-konstruksjonen i PGEX4-T32 og velg på en Ampicillin plate.
- Velg en enkelt transformant og vaksinere 5 mL LB + Ampicillin (5 μL av 100 mg/mL Ampicillin) i et 14 mL kultur rør og ruge ved 25 ° c med risting ved 200 RPM for 6-8 h.
Merk: På grunn av Leaky uttrykk, er det ikke anbefalt å ruge ved høyere temperaturer. Vekst ved 25 ° c reduserer aggregering av protein i løpet av denne vekstperioden. - Vaksinere 200 mL LB + Ampicillin med 1 mL av 5 mL kultur-og ruge over natten (~ 15 – 18 h) ved 25 ° c.
- Neste morgen, høste cellene av sentrifugering (2 000 x g i 10 min) og resuspend i 5 ml lb.
- Vaksinere 4 L av LB + Ampicillin og mål OD600 (0,05 – 0,15). Ruge ved 25 ° c med risting.
Merk: Reserve noen medier til å fungere som en blank for OD600 målinger før du legger bakterier. - Mål OD600 hver time til den når en OD mellom 0,4-0,5. På dette punktet, redusere temperaturen til 16 ° c.
- Indusere med 0,2 mM IPTH (800 μL av 1 M lager), 10 min etter at inkubator når 16 ° c. Ruge over natten (~ 15 – 18 h) ved 16 ° c.
Merk: Den lavere temperaturen forbedrer utbyttet av funksjonelt protein ved å redusere aggregering av atlastin. - Neste morgen, høste cellene ved sentrifugering ved 7 500 x g ved 4 ° c.
- Resuspend cellene i 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) og 200 mM KCl).
- Sentrifuger cellene ved 11 000 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Resuspend pellet i 40 mL bryte buffer (A200 pluss 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM imidazole, og en EDTA-fri protease inhibitor cocktail tablett).
Merk: Legg til TX-100 etter blanding for å unngå å generere bobler og skum. - Passere gjennom en 18 G nål og kjøre cellene gjennom en celle forstyrrelses tre ganger på ~ 10 000 psi.
- Sentrifuger ekstraktet på 125 000 x g for 1 t.
Merk: Alternativt oppløse pellet 1:2 (w:v) i 8 M urea og nutate ved romtemperatur over natten. Urea som en denaturant vil oppløse langsomt noe uløselig pelleted protein for SDS-side analyse. Lagre 1 μL for SDS-PAGE og Coomassie flekk analyse. - Filtrer ekstraktet gjennom en 0,45 μm cellulose nitrat steril membran filter for å fjerne bakterier og store bakterielle rusk.
Merk: du kan også lagre 1 μL for SDS-side og Coomassie flekk analyse.
-
Protein rensing av affinitet kromatografi
- Legg den filtrerte lysat på en immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) harpiks kolonne ladet med ni2 +, pre-equilibrated med lav imidazole buffer (A100 pluss 10% glyserol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mm imidazole) med en hastighet på 1 ml/ min ved 4 ° c.
- Vask kolonnen med 25 mL på A100 pluss 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazole med en hastighet på 1 mL/min ved 4 ° c. Eluere proteinet med en 30 mL lineær gradering av imidazole fra 40 mM til 500 mM, og en endelig 5 mL vask ved 500 mM.
- Pool sammen topp fraksjoner og ruge for 1 t ved 4 ° c med hovne GSH-Agarose perler, tidligere hovne i vann og equilibrated i A100 med 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, og 1 mM EDTA.
Merk: GSH-Agarose perler kan hovne i 50 mL vann dagen før og inkubert over natten ved 4 ° c, eller for 1 time ved RT. For å fjerne vann og likevekts buffer, sentrifuger i en svingende bøtte rotor på 500 x g for 1 min uten brems. Aspirer supernatanten med en 26 G nål. - Pellet GSH-Agarose perler av sentrifugering i en svingende bøtte rotor på 500 x g uten brems og fjerne lysat supernatanten ved aspirasjon med en 26 g nål.
- Overfør perlene til en 10 mL polyprep søyle og vask fem ganger med 5 mL likevekts buffer (A100 med 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, og 1 mM EDTA) ved sentrifugering ved 500 X g.
- Eluere proteinet med 1 – 1,5 mL likevekts buffer supplert med 10 mM reduserte glutation. Alikvot eluert protein og blits fryse i flytende nitrogen. Protein kan lagres ved-80 ° c i det uendelige.
Merk: Juster pH i eluering buffer til 7,4. - Kvantifisere proteinkonsentrasjon ved Amido svart protein analysen9 og vurdere RENHET ved SDS-side og Coomassie farging.
2. rekonstituering av rekombinant Atlastin til liposomer
- Liposome produksjon ved ekstrudering metode 10 andre
- Gjør lipid Mix aksjer i kloroform (10 mM totalt lipid). De nødvendige lipider er 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfat-L-Serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-YL) (neste arbeids DPPE) og 1, 2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (RH-DPPE). Acceptor liposomer består av POPC: DOPS (85:15 molar ratio) og donor liposomer av POPC: DOPS: RH-PE: neste arbeidsdag-PE (83:15:1.5, 1,5 molar ratio).
Merk: Mens POPC: DOPS lipid mikser har vært tradisjonelt brukt for in vitro lipid miksing analyser, alternative lipid komposisjoner kan tilpasses for ulike eksperimentelle formål. POPC: DOPS liposomer er svært stabile og vanskeligere å fusjonere, derfor er en svært strenge system for fusjon. - Tilsett 1 μCi/mL av L-α-dipalmitoyl-phosphatidylcholine (kolin metyl-3H) til lipid mikser for å bestemme lipid konsentrasjoner ved senere trinn ved flytende scintillation telling. Reserver minst 8 μL av denne aksjen.
- Overfør ønsket mengde lipid mikser til Flint glass rør.
- Tørk lipid mikser under en svak strøm av N2 gass i ~ 10 min til ikke mer kloroform er synlig.
- Tørk lipid filmen videre i en desikator ved støvsuging i 30 min.
- Legg nok vandig A100 med 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, og 1 mM EDTA til lipid film og bringe tilbake konsentrasjonen til 10 mM. Resuspend av lipid filmen ved virvlingen lett i 15 min ved romtemperatur. En vortexer som kan romme Flint glass rør anbefales.
- Frys-Tin hydrert lipider i flytende nitrogen ti ganger. Etter frysing i flytende nitrogen, tine liposomer ved å la løsningen sitte ved romtemperatur i 30 s, deretter overføre til vann for raskere tine. Dette fryse-tine sykling vil minimere multilamellar blemmer.
Forsiktig: Rørene kan sprekke hvis de inneholder volumer større enn 0,5 mL, og hvis de overføres direkte danner flytende nitrogen til vann. - Pass lipid gjennom polykarbonat filtre med 100 NM pore størrelse 19 ganger ved hjelp av mini-Ekstruder.
- Bestemme total lipid konsentrasjon av liposomer ved scintillation telling
Merk: Noen av lipid kan bli liggende igjen i glass rør og i mini-Ekstruder.- Tilsett 4 μL av lipid lager og liposomer i 3 mL scintillation cocktail.
- Mål gjennomsnittlig antall per minutt (CPMA) for lager og liposomer. Og Beregn liposomer konsentrasjon med følgende formel:
- Oppbevar liposomer ved 4 ° c i opptil en uke. Lengre lagringsplass anbefales ikke fordi liposomer kan akkumulere med tiden og redusere effektiviteten i rekonstituering.
- Gjør lipid Mix aksjer i kloroform (10 mM totalt lipid). De nødvendige lipider er 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfat-L-Serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-YL) (neste arbeids DPPE) og 1, 2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (RH-DPPE). Acceptor liposomer består av POPC: DOPS (85:15 molar ratio) og donor liposomer av POPC: DOPS: RH-PE: neste arbeidsdag-PE (83:15:1.5, 1,5 molar ratio).
- Rekonstituering av vaskemiddel assistert innlemmelse i preformed liposomer
- Beregn mengden av buffer, protein, liposomer og ekstra vaskemiddel som skal blandes sammen:
- Bestem ønsket total volum. Dette volumet består av buffer A100 med 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, og 1 mM EDTA. Volumer mindre enn 250 μL blandes ikke godt i 0,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Beregn volumet av liposomer som trengs for å gi en endelig lipid konsentrasjon på ca 1 mM. Trekk volumet fra buffer volumet.
- Beregn volumet av protein som trengs for å gi ønsket protein til lipid molar ratio (vanligvis 1:400). Reduser buffer volumet tilsvarende.
- Bestem hvor mye ekstra vaskemiddel må tilsettes for å mette liposomer sikter på en effektiv vaskemiddel til lipid ratio (REFF) mellom 0.64-0.8. Husk å vurdere vaskemiddel som tilsettes med proteinet. (REFF) bestemmes
av ligningen Dtotalt er den totale vaskemiddel konsentrasjonen og Dvann er monomere vaskemiddel konsentrasjon (0,18 mm for TX-100 og Anapoe X-100 i nærvær av vaskemiddel)4, 11i.
- Bland løsningene sammen i et 0,5 mL rør i følgende rekkefølge: buffer, vaskemiddel, protein og liposomer. Tilsett liposomer raskt og Vortex umiddelbart for 5 s å homogenisere blandingen.
- Ruge reaksjonen i en nutator i 1 time ved 4 ° c.
- Lag 0,2 g/mL polare polystyren adsorbent perle "slurry" i vann.
Merk: Gjør polystyren adsorbent bead "slurry" i løpet av forrige 1 h inkubasjons i trinn 2.2.3. - Veie ut 0,2 g av polystyren adsorbent perler og overføre til en mikrosentrifugen tube.
- Degas perlene ved å legge 1 mL metanol til røret og bland i 1 min. degassed perler vil synke.
- Aspirer metanol og tilsett vann til perlene. La perlene blandes med vann i 5 min, deretter aspirer vannet. Gjenta fire ganger, deretter bringe polystyren adsorbent perle "slurry" til 1 mL volum med vann og en endelig konsentrasjon av 0,2 g/mL.
Merk: Perler bør fortsatt bosette seg til bunnen av røret. Hvis de ikke gjør det, Degas igjen. Bruk en 21 G eller høyere nål til å aspirer metanol og vann fra perler. - Beregn mengden av polystyren adsorbent perler som trengs for å absorbere alle vaskemiddel i hver prøve. 1 g polystyren adsorbent perler absorberer 70 mg TX-100. For å beregne volumet av polystyren adsorbent perle slurry nødvendig for hver reaksjon, dele den totale vaskemiddel i reaksjonen (trinn 2.2.1.4) av 70 mg, og deretter ved konsentrasjonen av perle slurry (0,2 g/mL (trinn 2.2.7).
- Overfør beregnet mengde av polystyren adsorbent bead slurry til en 0,5 mL rør og aspirer vannet.
Merk: Skjær enden av en 20-200 μL spissen for å overføre perlene, Vortex røret like før pipettering til resuspend avgjort perler. - Legg prøvene til 0,5 mL rør som inneholder polystyren adsorbent perler og ruge prøven nutating for 1 t ved 4 ° c.
- Gjenta to ganger slik at gamle perler bak og overfører prøven til friske perler.
- Legg prøven til et fjerde rør med friske perler og ruge over natten (~ 15 – 18 h) ved 4 ° c.
- Beregn mengden av buffer, protein, liposomer og ekstra vaskemiddel som skal blandes sammen:
- I morgen, fjerne prøven fra polystyren adsorbent perler og pellets uløselig protein aggregater ved sentrifugering i 10 min ved 16 000 x g ved 4 ° c.
- Gjenopprette supernatanten og bestemme den endelige lipid konsentrasjonen av flytende scintillation telling (se trinn 2.1.9.2). Alternativt kan proteinkonsentrasjon bestemmes av Amido svart protein analysen9.
Merk: For atlastin proteoliposomes bør enzymatisk analyser utføres med friske liposomer. Lang lagring ved 4 ° c eller frysing fører til betydelig tap i atlastin aktivitet.
av ligningen Dtotalt er den totale vaskemiddel konsentrasjonen og Dvann er monomere vaskemiddel konsentrasjon (0,18 mm for TX-100 og Anapoe X-100 i nærvær av vaskemiddel)4, 11i.3. lipid blanding analyser
- Bring giveren og Acceptor proteoliposomes til en konsentrasjon på 0,15 mM hver i A100 med 10% glyserol, 2 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA og 5 mM MgCl2. Hver reaksjon (50 μL) bør legges til en brønn i en flat hvit 96 brønn plate egnet for fluorescens avlesninger. Forbered minst 4 reaksjoner inkludert en tre eksemplarer, og en no-GTP negativ kontroll.
- Plasser platen i en forvarmet plate leser ved 37 ° c. Mål fluorescens for neste arbeidsdag (eksitasjon 460 NM og utslipp 535 NM) i 5 minutter hver min.
- Indusere fusjon ved å tilsette 5 mM GTP (5 μL av 50 mM GTP).
- Mål fluorescens for neste arbeidsdag hvert minutt for 1 time.
- Tilsett 5 μL av 2,5% w/v n-Natriumdodecylsulfat β-D-maltoside for å oppløse proteoliposomes og måle den maksimale fluorescens for neste arbeidsdag. Les fluorescens for neste arbeidsdag i 15 minutter hver min.
4. liposome floatation på Iohexol usammenhengende gradient12
- Valgfritt Analyser effektiviteten ved rekonstituering ved å floatation analysene13.
- Forbered en 80% og en 30% w/v iohexol i A100 med 10% glyserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, og 1 mM EDTA. Iohexol ikke oppløses lett, så dette må være forberedt en dag før ved nutating over natten ved 4 ° c.
- Bland 150 μL av 80% iohexol lager med 150 μL av proteoliposomes prøve for å bringe den til en 40% iohexol. Legg dette til en 5 x 41 mm2 ultra-Clear tube unngå bobler.
- Lag 250 μL av 30% iohexol lager langsomt på toppen av prøven for å lage et mellomlag. Unngå eventuelle bobler og forstyrrer det nederste laget. På toppen av det midterste laget, sakte legge 50 μL av A100 med 2 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA.
- Sentrifuger graderingen i en svingende bøtte rotor på 220 000 x g for 4 t ved 4 ° c med langsom akselerasjon og ingen pause.
- Høste lagene av gradient og analysere ved SDS-side og Coomassie flekken, kvantifisering kan gjøres ved densitometri. Rekonstituert protein skal flyte til det øverste laget, mens protein og lipid aggregater vil sediment på bunnen eller i det midterste laget.
5. analyse av orientering av rekonstituert protein ved trombin proteinolyse
Merk: Den atlastin konstruere rapportert her har en trombin kuttet området mellom slutten av N-Terminal GST Tag og begynnelsen av atlastin. Atlastin i riktig retning vil ha dette kuttet nettstedet tilgjengelig for protease, mens protein i feil retning vil bli beskyttet av lipid bilayer.
- Til analysen atlastin proteoliposome orientering, reserver minst 8 μL av fersk rekonstituert proteoliposomes.
- Tilsett 8 μL av proteoliposomes og 1 μL av 1 U/μL trombin. Ruge ved 37 ° c for 1 time
- Slukke protease med 1 μL av 5 mg/mL av EDTA-fri protease inhibitor cocktail og ruge i 30 min ved 37 ° c.
- Analyser prøven ved SDS-PAGE og Coomassie beis. Andelen kløyvde og uncleaved protein kan bestemmes av densitometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av atlastin rekonstituering er presentert i figur 2. Rekonstituert proteoliposomes ble fløt i en iohexol usammenhengende gradient. Næringsdrivende protein ble sedimentert i det nederste laget (B) eller i det midterste laget (M). Rekonstituert protein ville flyte til det øverste laget (T). Prøver av gradient ble høstet og analysert av SDS-side og Coomassie farging. Kvantifisering av gelen ved densitometri viser en meget høy virkningsgrad ved rekonstituering med ubetydelig taper; 96% av det totale proteinet ble funnet som proteoliposomes som fløt til det øverste laget (T). Mindre enn 1% av proteinet ble unreconstituted og funnet i det midterste laget (M), og bare 3% ble unreconstituted eller aggregert og sedimentert til det nederste laget (B).
I tillegg til å beskrive omfanget av rekonstituering, var det å analysere orienteringen av atlastin etter rekonstituering kvantifisert av trombin i kløft14. Rekonstituert protein kan potensielt være i feil retning, det vil si mot lumenal plass i liposome. Protein i feil retning bør beskyttes mot proteinolyse av lipid bilayer. En trombin kløft området er kodet mellom slutten av N-Terminal GST Tag og begynnelsen av atlastin. Fløt proteoliposomes ble inkubert med trombin for 1 t ved 37 ° c, etterfulgt av en 30 min inaktive med EDTA-fri protease inhibitor. Prøvene ble analysert av SDS-PAGE og Coomassie beis og kvantifisert av densitometri Figur 3. Som en negativ kontroll, vises et utvalg av ubehandlet proteoliposomes i den venstre kjørefelt. Vaskemiddel solubilized proteoliposomes (høyre kjørefelt) fungerte som en positiv kontroll og for å vise omfanget av trombin kløft, med bare 1% venstre un-kløyvde. I alt dette analysen viser at det meste av rekonstituert protein ble kløyvde med bare 7% blir beskyttet fra protease (midten kjørefelt). Det er verdt å merke seg at resten av Uncut protein kan være et resultat av rekonstituert protein aggregater som kanskje ikke har kuttet området tilgjengelig. I alle disse resultatene beskriver et robust system for rekonstituering av atlastin.
Kinetics og omfanget av atlastin-mediert proteoliposome fusjon ble analysert ved lipid miksing analyser (figur 1). En prøve av atlastin Fusion Kinetics og kvantifisering er vist i Figur 4. Full kinetisk løpe er avbildet i figur 4a. En 5 min inkubasjons ble gjort før inducing fusjon med GTP på null timepoint og etter 1 h, n-Natriumdodecylsulfat β-D-maltoside ble lagt til solubilize den proteoliposomes og få maksimalt bånd utgivelse. Fusjonen maksimalt i oppkjøringen var av 11% av maksimal fluorescens (Figur 4B, C). Uninduced-kontroller (ingen GTP) kan brukes til å bestemme bakgrunns grunnlinjen.
Figur 1: Fusion analysen modell av liposome fusjon. En populasjon av merket liposomer med fluorescensmerkete merket fluorescerende donor lipider neste arbeidsdag-phosphatidylethanolamine (representert som grønne kuler) og Acceptor rhodamine-phosphatidylethanolamine (representert som røde kuler) blandes med en umerkede pool av liposomer. Før fusjon er fluorescens på neste arbeidsdag lav på grunn av nærheten til Acceptor fluoroforen, rhodamine. Ved fusjon med umerkede liposomer fører et areal økning til fortynning av sonder og en bånd utgivelse av neste arbeidsdag kan måles. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effektivitet for rekonstituering analysert av floatation analyser. Effektiviteten ved rekonstituering av atlastin kan måles ved floatation av proteoliposomes i en iohexol, usammenhengende gradering. Rekonstituert protein skal flyte som proteoliposomes til det øverste laget (T), mens unreconstituted og aggregert protein bør sediment til det nederste laget (B) eller det midterste laget (M). En Coomassie SDS-side gel ble kvantifisert av densitometri og målte 96% av den totale protein fløt som proteoliposomes med ubetydelig taper (~ 4%).
Figur 3: analyse av rekonstituert atlastin i proteoliposomes ved protease fordøyelsen. Rekombinant atlastin har en N-Terminal GST tag etterfulgt av en trombin cut sekvens. Proteoliposomes av rekombinant atlastin ble behandlet med Serine protease trombin å analysere orienteringen av rekonstituert protein i forhold til lipid bilayer. Etter trombin behandling blir protease hemmet og prøvene analyseres av SDS-PAGE, Coomassie beis, og kvantifisert av densitometri. De presenterte proteoliposomes har en lav andel av beskyttet protein, med bare 4% som forble ufordøyd (midtre kjørefelt). Som en positiv kontroll noen proteoliposomes var solubilized med vaskemiddel (0,5% TX100) (høyre kjørefelt); den negative kontrollen, ubehandlet proteoliposomes, var ikke kløyvde (venstre kjørefelt).
Figur 4: lipid miksing analyser av atlastin proteoliposomes. (A) sample Kinetic spor av fusjon reaksjon med en 5 min inkubasjonstid før inducing FUSJON med GTP på 0 min. Etter 1 h Run, ble vaskemiddel oppløseliggjøringen (svart pil) brukes til å bestemme den maksimale bånd utgivelsen av neste arbeidsdag. (B) zoomet inn i visningen av sporet fra timepoint 0 til 1 h med og (C) gjennomsnittlig fusjon (n = 3) av 11,3%. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene her avgrense en effektiv metode for rensing, rekonstituering av, og måle fusjon aktivitet av rekombinant atlastin. For å sikre høy avkastning av funksjonell atlastin noen kritiske skritt må vurderes. Atlastin må gjøres ved lave temperaturer (16 ° c) for å unngå aggregering, og man bør sikte på en endelig konsentrasjon mellom 0,4 – 1.5 mg/mL. Svært fortynnet protein vil ikke bli rekonstituert optimalt på et 1:400 protein til lipid ratio. Effektiviteten av rekonstituering kan eventuelt analyseres med floatation analyser beskrevet her (figur 2). En av fordelene med liposomer floatation analysene er at de kan utvides til å analysere oppløselige proteiner som forbinder med lipid bilayers13. I tillegg, orientering av rekonstituert protein kan også analyseres av protease fordøyelsen14, men dette kan ikke skille mellom rekonstituert misfolded eller aggregert protein eller rekonstituering i feil retning (Figur 3 ). Proteoliposomes utviklet av denne metoden kan brukes til analysen for fusjon eller for studier av atlastin i en modell lipid bilayer. Samtidig som prosessen med rekonstituering er forholdsvis enkel, kan små avvik fra optimalt vaskemiddel og lipid konsentrasjoner redusere effektiviteten av rekonstituering. For eksempel kan en overdreven mengde vaskemiddel føre til liposome oppløseliggjøringen.
Lipid miksing analyser krever en pool av donor og Acceptor liposomer (figur 1). Denne metoden bruker radioaktivitet ved tritiated lipid for kvantifisering av lipid konsentrasjon på hvert trinn. Det er imidlertid rapportert om alternative kvantifisering metoder ved hjelp av den innebygde fluorescens av giver liposomer og Acceptor liposomer med dansyl-phosphoethanolamine15,16. Størrelsen på liposomer kan også endres under ekstrudering, da størrelsen på polykarbonat-membranen kan justeres tilsvarende.
Mens lipid miksing analyser er en effektiv måte å analysere fusjon, kan det ikke skille mellom fusjon og hemifusion. Flere studier visualisere atlastin proteoliposomes etter fusjon av elektron mikroskopi15 og lipid fluorescens16,17 ytterligere støtte full fusjon av atlastin. Men når analysere spesifikke atlastin mutanter eller andre fusjon proteiner, er det av interesse å sikre full fusjon. Ytterligere trinn for å feilsøke dette kan gjøres ved å slukke den ytre pakningsvedlegget med dithionite og måling indre pakningsvedlegget lipid miksing. Alternative fusjon analyser, slik som indre vandig innhold miksing kan være ansatt for dette, men, ekstra trinn og dialyse av liposomer vil være nødvendig.
Det er av interesse at denne metoden kan brukes til andre membran proteiner for in vitro studier av proteiner i modell lipid bilayers. Andre membran proteiner har blitt rapportert å Rekonstituer med denne metoden16,17. Denne metoden kan derfor anvendes på en rekke membran-og fusjons proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Michael Stern og hans Lab for deres innsikt og tilbakemeldinger på atlastin relaterte prosjekter. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
