Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens
Summary
Karakteriseringen af cirkulerende tumorceller (CTCs) er et populært emne i Translationel forskning. Denne protokol beskriver en semi-automatisk immunofluorescens (IF) assay for PD-L1 karakterisering og optælling af Ctc’er i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patientprøver.
Abstract
Cirkulerende tumorceller (CTCs) afledt af den primære tumor er kastet ind i blodbanen eller lymfesystemet. Disse sjældne celler (1 − 10 celler pr. mL blod) berettiger en dårlig prognose og er korreleret med kortere samlet overlevelse i flere kræftformer (f. eks. bryst, prostata og kolorektal). I øjeblikket er anti-EpCAM-coated magnetisk perle baseret CTC-optagelses system den gyldne standard test, der er godkendt af U.S. Food and Drug Administration (FDA) til optælling af Ctc’er i blodbanen. Denne test er baseret på brugen af magnetiske perler belagt med anti-EpCAM markører, som specifikt er rettet mod epiteliale cancerceller. Mange undersøgelser har vist, at EpCAM ikke er den optimale markør for CTC-detektion. Ctc’erne er faktisk en heterogen delpopulation af kræftceller og er i stand til at gennemgå en epitel-til-mesenchymal Transition (EMT) forbundet med metastatisk proliferation og invasion. Disse Ctc’er er i stand til at reducere ekspression af celleoverfladen epitelial markør EpCAM, og samtidig øge mesenchymal markører såsom vimentin. For at imødegå denne tekniske forhindring er andre isolations metoder baseret på CTCs ‘ fysiske egenskaber blevet udviklet. Mikrofluidiske teknologier muliggør en etiket fri tilgang til CTC-berigelse fra hele blodprøver. Spiral mikrofluidisk teknologien bruger inerti og Dean trække kræfter med kontinuerlig flow i buede kanaler genereret i en spiral mikrofluidisk chip. Cellerne adskilles baseret på forskelle i størrelse og plasticitet mellem normale blodlegemer og tumorceller. Denne protokol beskriver de forskellige trin til at karakterisere den programmerede Death-ligand 1 (PD-L1) ekspression af ctcs, der kombinerer en spiral mikrofluidisk enhed med tilpasselig immunofluorescenstest (IF) markør sæt.
Introduction
Tumor antigen-specifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTLs) spiller en afgørende rolle i reaktionen på kræft gennem en proces kendt som kræft “immun overvågning”. Deres anti-tumor funktioner er forstærket af immun check point blokade antistoffer såsom CTLA-4 hæmmere og PD-1/PD-L1-hæmmere. I ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) resulterer anti-PD-1/PD-L1-behandlinger i responsrater fra 0%-17% hos patienter med PD-L1-negative tumorer og 36%-100% hos dem, der udtrykker PD-L1. De robuste responser på PD-1/PD-L1-blokade observeret i melanom og NSCLC fremgår af evidens for forbedret samlet responsrate (RR), varige kliniske fordele og progressionsfri overlevelse (PFS). På nuværende tidspunkt er anti-PD1-behandlinger standarden for pleje i anden-linjebehandling med nivolumab, uanset PD-L1-ekspression og pembrolizumab hos patienter, der udtrykker PD-L1 ≥ 1%. I førstelinjebehandling er standard for pleje pembrolizumab alene hos patienter med NSCLC, der udtrykker PD-L1 ≥ 50% og kan potentielt forstærkes med kemoterapi (platin og Doublet-lægemiddel afhængigt af histologisk under type)1,2.
Imidlertid kan en sådan tilgang til patienthåndtering diskuteres3, da PD-L1-ekspression i tumorceller ved immun histokemi (IHC) formentlig ikke er den mest ideelle ledsager biomarkør. Andre såsom tumor mutation byrde4 (TMB), microsatellite ustabilitet (MSI), og/eller mikrobiota er muligvis interessant i denne indstilling enten alene eller i kombination. NSCLC er kendt for at være heterogene tumorer, enten rumligt (fra en tumor site til en anden) eller temporalt (fra diagnose til gentagelse). Patienter med NSCLC er normalt skrøbelige, og iterativ invasive vævsbiopsier kan være et problem. Faktisk, re-biopsi sats ved første progression varierer fra 46%-84% afhængigt af serien, og vellykket re-biopsi (betydning med histologisk og fuld molekyl analyse) spænder fra 33%-75%. Det betyder, at 25%-67% af patienterne ikke kan få en omfattende re-biopsi analyse under første progression5,6,7,8.
Fremkomsten af “flydende biopsier” har således skabt betydelig entusiasme i denne særlige indstilling, da det muliggør en afgørende revurdering af molekylære ændringer under sygdomsprogression ved at undersøge cirkulerende frit DNA (cfDNA) afledt af cirkulerende tumorceller (Ctc’er). Disse levende celler frigives fra tumoren ind i blodbanen, hvor de cirkulerer frit. Selvom det ikke rutinemæssigt anvendes, synes analysen af Ctc’er at være meget lovende i tilfælde af molekylær og fænotypisk karakterisering, prognose og prædiktiv betydning i lungekræft (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna og proteinanalyse). Faktisk CTCs sandsynligvis havn fænotypiske karakteristika af den aktive sygdom snarere end de oprindelige markører (påvist på vævsbiopsier på diagnose). Endvidere, CTCs omgå problemet med rumlig heterogenitet af tumor væv, som kan være et afgørende spørgsmål i små biopsier. PD-L1-ekspression på Ctc’er kan derfor potentielt kaste lys over de afvigelser, der er afledt af dets anvendelse som prædiktiv biomarkør ved hjælp af tumor væv.
For nylig er PD-L1-ekspression blevet testet i Ctc’er af NSCLC. Næsten alle de testede patienter9 var PD-L1-positive, hvilket komplicerede fortolkningen af resultatet og dets kliniske anvendelse. Samlet set blev PD-L1-positive Ctc’er påvist i 69,4% af prøverne fra et gennemsnit på 4,5 celler/mL10. Efter initiering af strålebehandling steg andelen af PD-L1-positive ctc’er signifikant, hvilket indikerer docetaxels opregulering af PD-L1-ekspression som reaktion på stråling11. Derfor kan PD-L1 CTCs-analyse anvendes til at overvåge dynamiske ændringer af tumor og immunrespons, som kan afspejle reaktionen på kemoterapi, stråling, og sandsynlige immunterapi (IT) behandlinger.
Til dato er ctcs isolation og PD-L1 karakterisering afhængige af forskellige metoder såsom anti-epcam-coated magnetisk perle baseret CTC-optagelse, berigende-fri baseret assay og størrelses baserede12,13 CTC-Capture-assays. Ctc’erne blev imidlertid kun påvist hos 45%-65% af patienterne med metastatisk NSCLC, hvilket begrænser deres evne til at give oplysninger til mere end halvdelen af de metastatiske NSCLC-patienter. Desuden var CTC-optællingen lav i de fleste af disse undersøgelser ved hjælp af størrelses baseret tilgang10. Desuden har denne metode ført til uoverensstemmelser såsom påvisning af CD45 (-)/DAPI (+) celler med “cytomorfologiske mønstre af malignitet” i blodbanen af raske donorer. Disse bekymringer understreger behovet for en meget følsom metode til CTC-indsamling forbundet med immun-phenotyping af atypiske CD45 (-) celler fra sundt fuldblod ved hjælp af yderligere kræft biomarkører (dvs., TTF1, Vimentin, EpCAM og CD44) i NSCLC.
Derfor vurderede vi en spiral mikrofluidisk enhed, der bruger inerti og Dean trække kræfter til at adskille celler baseret på størrelse og plasticitet gennem en mikrofluidisk chip. Dannelsen af Dean vortex strømme til stede i mikrofluidisk chip resulterer i større ctcs placeret langs den indre væg og mindre immunceller langs den ydre væg af chippen. Berigelses processen afsluttes ved, at de større celler overføres til opsamlings udtaget som den berigede CTC-fraktion. Denne metode er særlig følsom og specifik (påvisning af ca. 1 CTC/mL fuldblod)14 og kan forbindes med tilpassede immunofluorescens (IF) analyser. Disse værktøjer vil gøre det muligt at indføre en positiv tærskel for klinisk tolkning. En arbejdsgang er således beskrevet, der gør det muligt for biologer at isolere og immunophenotype Ctc’er med en høj restitutionssats og specificitet. Protokollen beskriver optimal brug af spiral mikrofluidisk enhed til at indsamle ctcs, den optimerede hvis assays, der kan tilpasses i henhold til kræfttype, og brug af gratis open source-software til måling og analyse af celle billeder til at udføre en semi-automatisk nummerering af cellerne i henhold til fluorescerende farvning. Desuden kan mikroskop multiplexing udføres afhængigt af antallet af fluorescerende filtre/markører til rådighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
To vigtige punkter blev rejst i denne undersøgelse, den første med hensyn til udførelsen af arbejdsprocessen for sin overførsel til kliniske anvendelser, og den anden om nedgangen i subjektivitet for analysen af fluorescensbilleder opnået.
En ydende og optimeret arbejdsgang for CTC-optælling blev oprindeligt bestemt ved hjælp af tilpasselig if-analyse efter celle berigelse via et CTC-label-frit mikrofluidisk-system (spiral mikrofluidisk-enhed). Ved hjælp af denne arbejdsgang bekræfted…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskningsstipendier fra AstraZeneca (London, Det Forenede Kongerige), Biolidics (Singapore) og Ligue contre Le cancer (Saone et Loire, Frankrig). Forfatterne takker AstraZeneca og Biolidics virksomheder for deres økonomiske støtte.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. “Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
