Summary
האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.
Abstract
במחזור תאים סרטניים (CTCs) נגזר הגידול העיקרי הם לשפוך לתוך הדם או מערכת הלימפה. אלה תאים נדירים (1-10 תאים לכל mL של דם) צו פרוגנוזה גרועה מתואמים עם הישרדות הכוללת קצר יותר בסרטן מספר (g., השד, הערמונית המעי הגס). כיום, anti-EpCAM-מצופה מגנטי חרוז מבוסס CTC לכידת מערכת היא הבדיקה הסטנדרטית זהב שאושרו על ידי ארה ב. מינהל המזון והתרופות (FDA) לספירת CTCs במחזור הדם. בדיקה זו מבוססת על השימוש חרוזים מגנטיים מצופה עם אנטי EpCAM סמנים, אשר במיוחד יעד תאים סרטניים אפיתל. מחקרים רבים מומחשים כי EpCAM אינו סמן אופטימלי עבור זיהוי CTC. אכן, CTCs הם אוכלוסיית משנה הטרוגנית של תאים סרטניים והם מסוגלים לעבור מעבר אפיתל-to-mesenchal (חובש) הקשורים התפשטות גרורתית ופלישה. CTCs אלה מסוגלים להפחית את הביטוי של משטח התא האפיתל סמן EpCAM, תוך הגדלת סמנים mesenchymal כגון vimentin. כדי לטפל במשוכה טכנית, פותחו שיטות בידוד אחרות המבוססות על תכונות פיזיות של CTCs. טכנולוגיות מיקרופלואידיסי מאפשרות גישה נטולת תוויות להעשרה CTC מדגימות דם שלמות. הטכנולוגיה מיקרופלואידיג ספירלה משתמשת האינרציה וכוחות לגרור דין עם זרימה רציפה בערוצים מעוקלים שנוצר בתוך שבב מיקרופלואידיג ספירלה. התאים מופרדים על בסיס הבדלים בגודל ובפלסטיות בין תאי דם נורמליים ותאים מוסריים. פרוטוקול זה מפרט את השלבים השונים כדי לאפיין את ביטוי המוות מתוכנת (PD-L1) של CTCs, שילוב מכשיר מיקרופלואידיג ספירלה עם להתאמה אישית מערכת הסימון החיסונית (IF) מוגדר.
Introduction
אנטיגן הגידול-ספציפי ציטוטוקסיים T-לימפוציטים (CTLs) לשחק תפקיד מכריע בתגובה לסרטן באמצעות תהליך המכונה סרטן "מעקב החיסונית". הפונקציות שלהם נגד הגידול משופרות על ידי נוגדנים הסגר מחסום חיסונית כגון CTLA-4 מעכבי ו-PD-1/PD-L1 מעכבי. בתוך סרטן ריאות תא קטן (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 תרפיות התוצאה שיעורי תגובה החל 0%-17% בחולים עם PD-L1-שלילי גידולים ו-36%-100% אלה ביטוי PD-L1. התגובות החזקות של PD-1/PD-L1 המצור נצפתה מלנומה ו-NSCLC מוצגים על ידי ראיות של שיפור שיעור התגובה הכולל (RR), הטבות קליניות עמידים, ו-הישרדות ללא התקדמות (PFS). כיום, הטיפולים anti-PD1 הם הסטנדרטים של טיפול בשורה השנייה NSCLC עם nivolumab ללא קשר לביטוי PD-L1 עם פמרופזואב בחולים ביטוי PD-L1 ≥ 1%. בטיפול בשורה הראשונה, התקן של טיפול הוא פפמוליזאז לבד בחולים עם nsclc ביטוי PD-L1 ≥ 50% והוא יכול להיות משופר עם כימותרפיה (פלטין ובספק התרופה בהתאם לסוג היסטולוגית)1,2.
עם זאת, גישה זו לניהול החולה הוא שויכוח3, מאז PD-L1 ביטוי בתאי הגידול על ידי אימונוהיסטוכימיה (ihc) הוא כנראה לא האידיאלי ביותר לוויה ביואריקר. אחרים כגון נטל מוטציה הגידול4 (tmb), אי יציבות MICROSATELLITE (MSI), ו/או microbiota הם אולי מעניינים בהגדרה זו בלבד או בשילוב. Nsclc ידועים להיות גידולים הטרוגנית, או מרחב (מאתר הגידול לאחד אחר) או באופן זמני (מאבחנה להישנות). חולים עם NSCLC הם בדרך כלל שבירים, ו איטרטיבי רקמות פולשני עשוי להיות בעיה. אכן, re-ביופסיה שיעור בטווחים התקדמות ראשונה מ 46%-84% בהתאם לסדרה, ומוצלחת re-ביופסיה (כלומר עם ניתוח מולקולרי היסטולוגית ומלאה) נע בין 33%-75%. משמעות הדבר היא כי 25%-67% מהחולים לא יכולים לקבל ניתוח מחדש מקיף ביופסיה במהלך ההתקדמות הראשונה5,6,7,8.
הופעתו של "ביופסיות נוזלי" יצרה כך התלהבות ניכרת בהגדרה זו מסוים, כפי שהיא מאפשרת הערכה מכרעת של שינויים מולקולריים במהלך התקדמות המחלה על ידי בחינת מחזורי DNA חינם (cfDNA) נגזר במחזור תאים סרטניים (CTCs). אלה תאים חיים שוחררו מן הגידול לתוך זרם הדם, שם הם להסתובב בחופשיות. למרות שלא נעשה שימוש באופן שגרתי, הניתוח של CTCs נראה מבטיח מאוד במקרה של אפיון מולקולרי, פנוטי, פרוגנוזה, ומשמעות חזוי בסרטן הריאות (דרך Dnaseq, Rnaseq, mirna וניתוח חלבון). אכן, CTCs סביר להניח הנמל מאפיינים של המחלה הפעילה ולא את הסמנים הראשוניים (זוהה על ביופסיות רקמה באבחון). יתר על כן, CTCs לעקוף את הבעיה של טרוגניות מרחבית של רקמת הגידול, אשר עשוי להיות נושא מכריע ביופסיה קטנה. כתוצאה מכך, הביטוי PD-L1 ב-CTCs עשוי לשפוך אור על אי-התאמות הנגזרות מהשימוש בו כסמן חזוי באמצעות רקמת הגידול.
לאחרונה, ביטוי PD-L1 נבדק ב-CTCs של NSCLC. כמעט כל המטופלים נבדקו9 היו PD-L1 חיוביים, מסבך את הפרשנות של התוצאה ואת השימוש הקליני שלה. הכולל, PD-L1-CTCs החיוביים זוהו ב 69.4% של דגימות מ ממוצע של 4.5 תאים/mL10. לאחר החניכה של טיפול בקרינה, היחס של CTCs PD-L1-חיוביים העלה באופן משמעותי, המציין upregulation של ביטוי PD-L1 בתגובה קרינה11. מכאן, הניתוח PD-L1 CTCs עשוי לשמש כדי לנטר שינויים דינמיים של הגידול ואת התגובה החיסונית, אשר עשוי לשקף את התגובה לכימותרפיה, קרינה, וסביר טיפול חיסוני (IT) טיפולים.
עד היום, בידוד ctcs ואפיון PD-L1 מסתמכים על שיטות שונות כגון אנטי-epcam-מצופה מגנטי מבוסס חרוזים CTC לכידת, העשרה המבוססת על מבוסס בחינם, וגודל מבוסס12,13 CTC לכידת assays. עם זאת, CTCs זוהו רק 45%-65% מהחולים עם NSCLC גרורתית, ובכך להגביל את יכולתם לספק כל מידע עבור יותר ממחצית מהחולים NSCLC גרורתית. בנוסף, CTC ספירה היה נמוך ברוב המחקרים הללו באמצעות גודל מבוסס גישה10. יתר על כן, שיטה זו הובילה לסתירות כגון זיהוי של CD45 (-)/DAPI (+) תאים עם "הדפוסים הציפולוגיים של ממאירות" במחזור הדם של תורמים בריאים. חששות אלה להדגיש את הצורך בשיטה רגישה מאוד של אוסף CTC הקשורים החיסונית-פנוטיפים של טיפוסי CD45 (-) תאים מדם שלם בריא באמצעות סמנים סרטניים נוספים (כלומר, TTF1, Vimentin, EpCAM, ו CD44) ב NSCLC.
כתוצאה מכך, הערכנו מכשיר מיקרופלואידיג ספירלי שמשתמש באינרציה והדיקן גורר כוחות כדי להפריד בין תאים בהתאם לגודל ולפלסטיות באמצעות שבב מיקרופלואידיסי. היווצרות של מערבולת דין זורם בנוכחות שבב microfluidic התוצאות CTCs גדול יותר הממוקם לאורך הקיר הפנימי ותאים חיסוניים קטנים יותר לאורך הקיר החיצוני של השבב. תהליך ההעשרה מושלם על ידי שאיפה התאים הגדולים ביותר לשקע הגבייה כשבר CTC מועשר. שיטה זו רגישה במיוחד וספציפית (זיהוי של סביב 1 CTC/mL של דם שלם)14 והוא יכול להיות משויך עם ניתוח החיסונית המותאם אישית (IF). כלים אלה יאפשרו הגדרה של סף חיובי לפרשנות הקלינית. באופן זה מתואר זרימת עבודה המאפשרת לביולוגים לבודד ולהחיסלול CTCs בקצב גבוה של שחזור וספציפיות. הפרוטוקול מתאר שימוש אופטימלי במכשיר המיקרופלואידיג ספירלה כדי לאסוף CTCs, האופטימיזציה IF ממוטבת שניתן להתאים אישית על פי סוג סרטן, ושימוש חינם בקוד פתוח תוכנה למדידת וניתוח תמונות תא לבצע חצי אוטומטי מונה התאים בהתאם לצביעת פלורסנט. בנוסף, ריבוב מיקרוסקופ יכול להתבצע בהתאם למספר מסנני פלורסנט/סמנים זמינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות נאספו באופן מיותר בתוך המסגרת של מעגלי ("מחזורי סרטן") מבוסס בבית החולים באוניברסיטת ליון לאחר הסכמה בכתב המטופל. מחקר זה שולב CIRCAN_ALL. CIRCAN_ALL המחקר הוכרה כבלתי התערבותית על ידי CPP דרום מזרח IV מתוארך 04/11/2015 תחת התייחסות L15-188. גרסה מתוקנת הוכרה כבלתי התערבותית על 20/09/2016 תחת התייחסות L16-160. מחקר CIRCAN_ALL הוכרז לכתב ה-IT והחופש של הויניקס Civils דה ליון על 01/12/2015, תחת התייחסות 15-131. אוסף הדם בוצע כאשר הרופאים הבחינו האינדיקציה המוקדמת של התקדמות הגידול.
הערה: השתמש כל ריאגנטים וחומרים המתוארים בטבלה של חומרים עם תנאי אחסון בהתאמה להכנה מראש ניתוח לדוגמא ומחלות אימונולונציה. החלפת מצבי האחסון של ריאגנטים ו/או שינוי מצבם עלולה לגרום לביצועי שיטת משנה.
1. טיהור התקן מיקרופלואידיג ספירלי
הערה: טיהור של המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה היא דרישה להסיר את כל הרקע immunofluorescence שנוצר מזיהום חיידקים, לחקור את הסייטופולוגיה של CTCs, ולהיות מסוגל להבדיל אותם מתאי החיסון נורמלי. הפרוטוקול הוא אופטימיזציה עבור דגימות דם שנאסף K2edta צינורות בתוך 6 h לאחר דגימת דם ומועשר באמצעות המכשיר המיקרופלואידיג ספירלה בתנאים נקיים. השימוש בשיטה זו לסוגים אחרים של דגימות (נוזלים ביולוגיים אחרים) עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. פרוטוקול הטיהור הזה צריך. להתבצע פעם בשבוע
- הכנת ריאגנטים
- הכנת מאגר הדילול
- לחטא 20 מ ל של מדלל תוסף מגיב באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר מזרק ולהוסיף ישירות ל 1 L של מאגר מלוחים של 1 x פוספט (PBS) אולטרה טהור (שולחן חומרים).
- עיקור של ריאגנטים ומקש הזנה
- חטא את מאגר הליזה RBC ואת מאגר ההשעיה מחדש (RBC; רשימת חומרים) באמצעות פילטר מזרק מ0.22 יקרומטר ומניות בשפופרת שפופרת פוליפרופילן חדשה באורך 50 mL לכל פתרון.
- לחטא את הקש הקלט על ידי הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 h ב ניקוי לכל מטרה מגיב (טבלת חומרים). להעביר את הקש על החומר ניקוי מבוסס אקונומיקה (טבלת חומרים) ו-הדגירה ב RT עבור 1 h.
- לשטוף את קש הקלט פעמיים עם ה-PBS סטרילי עבור 1 h כל אחד ולאחסן את קשית הקלט מעוקר בשקית סטרילי (טבלת חומרים).
- הכנת מאגר הדילול
- Decontaminating התקן המיקרופלואידיג הספירלי
- חיטוי באמצעות מגיב לכל מטרה
- לנתק את המכסה בקבוק מדלל את הנמל מדלל את המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה על ידי הסרת דופק בורג חום. תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי, העבר עד 250 mL של מגיב לכל מטרה לניקוי (טבלת חומרים) לבקבוק ריק חדש.
- לעזאזל עם כובע בקבוק מדלל קש לבקבוק של 250 mL כל מטרה לניקוי מגיב תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית. חברו את הבקבוק הזה לנמל הדילול של המכשיר המיקרופלואידיג הספירלי על ידי החזרת הבורג החום.
- העברת עד 100 מ ל של אקונומיקה (1% הריכוז הסופי; רשימת חומרים) למיכל הפסולת המסופק בערכת ההפעלה (איור 1א).
- טען קש קלט סטרילי חדש אל המכשיר המיקרופלואידיג הספירלי (טבלת חומרים) ביציאת הקלט. טען צינורית צנטריפוגה חדשה 50 mL ביציאת הקלט. טען צינורית צנטריפוגה חדשה 50 mL ביציאת הפלט.
- המשך לראש התקן מיקרופלואידיג ספירלה על ידי לחיצה על פריים על המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה (3 דקות). הסר את צינור הקלט לאחר השלמת השיא.
- העברת עד 15 מ"ל של ניקוי כל מטרה מגיב לצינור חדש 50 mL עם מטלית סרוולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית ולחבר את הצינור ליציאת הקלט של המכשיר הספירלי microfluidic.
- לפני תחילת ההפעלה, בדוק כי הפתרון הוא ללא בועות מוגזמת. אם יש בועות בהווה, להסיר אותם על ידי שאיפה איטית עם פיפטה.
- טען שבב מיקרופלואידיג טיהור במכשיר מיקרופלואידיג ספירלה. הפעל תוכנית 3 על המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה על ידי לחיצה על הפעל ובחירת התוכנית 3 (31 דקות).
הערה: התוכנית 3 של המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה מאפשרת העשרה מהירה של CTCs בתוך 31 דקות. - המשך עם המכשיר הספירלי מיקרופלואידיג מכשיר הניקוי באמצעות הנפח הנותר של ניקוי כל מטרה מגיב בצינור הקלט.
- התעלם מצינור הקלט לאחר השלמת שלב הניקוי, והשארת מאחורי מקש הקלט.
- טיהור שימוש בסוכן הניקוי המבוסס על אקונומיקה
- לנתק את כובע ניקוי כל מטרה מגיב בקבוק מן הנמל הדילול של המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה על ידי הסרת דופק בורג חום. תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי, העבר עד 250 mL של סוכן ניקוי מבוסס אקונומיקה (טבלת חומרים) בבקבוק ריק חדש (איור 1א).
- לעזאזל עם המכסה של בקבוק הניקוי החומרי והקש לבקבוק המכיל את סוכן הניקוי המבוסס על אקונומיקה תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי. חברו את הבקבוק הזה לנמל הדילול של המכשיר המיקרופלואידיג הספירלי על ידי החזרת הבורג החום.
- העברת עד 15 מ ל של סוכן ניקוי המבוסס על אקונומיקה לצינור קלט שפופרת חדש 50 mL באמצעות פיפטה סרוולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי. טען את מיקום הכניסה לצינורית צנטריפוגה 50 mL. טען צינור ריק במיקום פלט.
- לפני עיבוד הפעלה, בדוק כי המדגם הוא ללא בועות מוגזם, אם הם קיימים, להסיר את הבועות על ידי הפחתת אותם לאט עם פיפטה.
- הפעל תוכנית 3 על- ידי לחיצה על הפעלה ובחירה בתוכנית 3 (31 דקות). לאחר ההפעלה, המשך ישירות לשלב הניקוי באמצעות הנפח הנותר של סוכן ניקוי המבוסס על אקונומיקה בשפופרת הקלט.
- התעלם מצינורות הקלט והפלט.
- לשטוף את המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה.
- נתק את המכסה מבוסס אקונומיקה בקבוק כובע מן הנמל מדלל את המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה על ידי הסרת דופק בורג חום. תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית, העבר את הקש מהבקבוק המכיל את סוכן הניקוי המבוסס על אקונומיקה לבקבוק החדש המכיל את המאגר הדילול. לעזאזל עם הבקבוק למכשיר המיקרופלואידיג הספירלי.
- העברת עד 15 מ ל של מים מעוקרים (טבלת חומרים) לצינור שפופרת חדש 50 mL של צנטר באמצעות פיפטה סרוולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית. טען את מיקום הכניסה לצינורית צנטריפוגה 50 mL. טען צינור ריק במיקום פלט.
- לפני עיבוד הפעלה, בדוק כי המדגם הוא ללא בועות מוגזם, אם הם קיימים, להסיר את הבועות על ידי הפחתת אותם לאט עם פיפטה.
- הפעל תוכנית 3 על- ידי לחיצה על הפעלה ובחירה בתוכנית 3 (31 דקות). לאחר הריצה, המשך ישירות לשלב הניקוי תוך שימוש בנפח הנותר של מים מעוקרים בשפופרת הקלט.
- התעלם מצינורות הקלט והפלט.
- חיטוי באמצעות מגיב לכל מטרה
2. תחזוקה לשמור על המכשיר הספירלי מיקרופלואידיג חיידקים-חינם
הערה: יש לבצע את התחזוקה השוטפת בסוף היום במהלך שלב הניקוי האחרון.
- העברה עד 7 מ ל של סוכן ניקוי מבוסס אקונומיקה לתוך שפופרת הצנטריפוגה החדשה 50 mL באמצעות פיפטה סרוולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית. לעזאזל בצינור ניקוי מבוסס אקונומיקה ביציאת קלט של המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה.
- לפני שאתה מעבד את ההפעלה הנקייה, בדוק כי מדגם הקלט הוא חופשי של בועות מוגזמות ואם הם קיימים, להסיר את הבועות על ידי מרוקן אותם לאט עם פיפטה.
- הפעל את הנקי על המכשיר המיקרופלואידיג ספירלה.
3. העשרת מקדם אנליטי של CTC מדגימות דם החולה
- לאסוף 7.5 mL של דם בצינור K2edta ולשמור על עצבנות עדין כדי למנוע משקעי תאים קרישה. תהליך בתוך 6 שעות.
הערה: אם הדם נאסף בצינור DNA ללא תא המכיל משמר, חנות ב 4 ° צ' עד העיבוד. ודא שדגימת הדם, מאגר הליזה RBC ומאגר ה-RBS נמצאים ב-RT לפני שתמשיך בשלב ההעשרה. - העברת עד 7.5 mL של דם שלם לצינור החדש 50 ml הצינור כניסת שפופרת באמצעות הצנרת סרולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית.
- צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 10 דקות ב RT. לאסוף את שבר פלזמה עם פיפטה מבלי להפריע מעיל באפי. החלף את שבר הפלזמה על-ידי הוספת נפח המקבילה הישיר של PBS עד 7.5 mL.
- הוסף בעדינות את מאגר הליזה RBC (טבלה של חומרים) כדי דגימת דם לנפח הסופי של 30 מ ל (עבור שפופרת K2edta) או 37.5 mL (עבור שפופרת האוסף של ה-DNA חינם תא). בעדינות להפוך את הצינור דם x 10x ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
הערה: דגימת הדם הופכת לאדומה כהה יותר במהלך הליזה RBC. אם לא שינוי (מאדום כהה ואטום) הוא נצפתה לאחר 10 דקות, בעדינות להפוך את הצינור 3x ולהשאיר לעמוד עוד 5 דקות מקסימום. אין להשאיר את המדגם במאגר הליזה RBC במשך יותר מ -15 דקות משום שהוא יכול לפגוע באיכות המדגם ובביצועי השיטת הדגימה. - צנטריפוגה את דגימת הדם למטה ב 500 x g עבור 10 דקות at RT, עם בלמים צנטריפוגה על (או מהירות ההאטה הגבוהה ביותר). השתמשו בפיפטה פסטר או בפיפטה סרוולוגית כדי להסיר בעדינות את הסופרנטאנט עד שעוצמת הקול תגיע לסימן 4-5 mL. לאחר מכן, השתמש בתיאורי מיקרופיפטה מסוננים כדי להסיר את הסופרנטאנט הנותר.
- באמצעות P1000 מיקרופיפטה עם טיפ מסונן, הוסף 1.0 mL של RSB לקיר של שפופרת הקלט של צנטריפוגה מ ל 50 mL. כדי למנוע היכרות בועות לתוך תערובת, להשעות מחדש את הגלולה התא על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עד המדגם הוא הומוגנית.
- הוסף 3 מ ל נוסף של RSB אל הקיר של 50 mL כניסת צינורית הצינור (כולל נפח 4 מ ל). להימנע מציג בועות לתוך תערובת. בעדינות לערבב את ההשעיה התא על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה.
הערה: במקרה הלא סביר כי ליטוף רגיל אינו מסוגל לשבור את הגושים תאים (מוגדר על ידי להיות גלוי או חוסם את העצה פיפטה), לסנן את המדגם באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר כדי להסיר את כל הגושים. הוסף 150 μL של RSB למדגם כדי לפצות על אובדן העוצמה מסינון. שים לב שיש להשתמש בשיטה זו בצורה מצומצמת ורק כאשר מתבוננים בגושים גדולים. - לפני שתמשיך לשלב ההעשרה, בדוק כי המדגם הוא ללא בועות מוגזם, אם הם קיימים, להסיר את הבועות ולדאוג לא להשליך כל דגימה. אם בועות זעירות קיימות, ההסרה שלהם אינה נדרשת.
- לעבד את המדגם על המכשיר המיקרופלואידיג ספירלה.
4. העשרת מחשבי CTCs מן החולה דם עם מכשיר מיקרופלואידיג ספירלי
- . לטעון שבב מיקרופלואידיג ספירלי חדש טען שני צינורות צנטריפוגה 50 mL ריקים ביציאות קלט ופלט.
- הפעל פריים על ידי לחיצה על פריים על המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה (3 דקות). הסר את צינורות הקלט והפלט וטען את המדגם שיעובד ביציאת קלט.
- טען צינור ברור של 15 מ"ל ביציאת פלט כדי לאסוף CTCs מועשר. הפעל תוכנית 3 על-ידי לחיצה על הפעל ובחירת התוכנית 3 (31 דקות).
- פרוק את צינור הפלט ואת הצנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות (האצה: 9; האטה: 5). בעזרת פיפטה בגודל 5 מ ל, מסירים את הסופרנטאנט באמצעות מיכל 2 מ ל בשפופרת התחתית החרוט 15 מ ל. בעזרת מיקרופיפטה, הסירו את הסופרנטאנט בשעה 100 μL לסימון בשפופרת של 15 מ ל החרוט. מעבדים את המדגם המועשר ישירות עבור כתמים אימונולואוורנציה.
5. כתמים אימונולואורוסנס
- ספירה על שקופית עם רשת מסוג הומוציטוטומטר מספר התאים לכל mL. לדלל את המדגם מועשר עם 0.2% אנטי מחייב פתרון (טבלת חומרים) לריכוז להגיע 100,000 תאים/100 μl לכל ציטוספין.
- מויסטן את המתאר של התא לדוגמה באמצעות כותנה (טבלת חומרים) עם 50 μl של 0.2% אנטי מחייב פתרון. מניחים שקופית זכוכית פולייזין בחדר המדגם וקרוב.
- מעיל טיפ עם 0.2% הפתרון נגד מחייב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 3x. השהה מחדש את הדגימה המועשרת והעבר את פתרון התא לתוך תא המדגם. צנטריפוגה עם צנטריפוגה ייעודי (טבלת חומרים) ב 400 סל ד עבור 4 דקות (האצה נמוכה).
- הניחו סיליקון מבודדים סביב אזור התצהיר. בואו לייבש את הזכוכית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי במשך 2 דקות.
- הכינו את פתרון הקיבעון על ידי דילול 1 מ ל של 16% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עם 3 מ ל של הערוץ הסטרילי. הוסף 100 μL של פתרון קיבעון (4% בתחתית) לכל מדגם ו-מודטה ב-RT עבור 10 דקות. הסר פתרון קיבעון ולבצע שלוש שוטף עם 200 μL של PBS ו-דגירה ב RT כל אחד עבור 2 דקות.
זהירות: השתמש בחצי הכדורגלן תחת ארון בטיחות כימי כדי למנוע אינהלציה. - הכינו את פתרון הרוויה על ידי דילול סרום העוברי (FBS) ב 5%, הקולטן Fc (Fbs) חסימת מגיב ב 5%, ו סרום הפרה אלבומין (BSA) ב 1% ב-PBS סטרילי (טבלת חומרים). הוסף 100 μL של פתרון רוויה לכל מדגם ו-דגירה עבור 30 דקות ב-RT. הסר את פתרון הרוויה.
- הוסף 100 μL של פתרון נוגדן לכל מדגם (CD45 נוגדן 1/20; הנוגדן 1/500; L1 המשטרה-נוגדן 1/200; פתרון רוויה qsp 100 μL) (טבלת חומרים). מניחים את השקופית זכוכית פולייזין ב 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי. מויסטן נייר סופג עם 2 מ ל של מים סטריליים ולסגור את צלחת פטרי עם המכסה. הניחו את המקום ב -4 ° c ללילה והגנו מהאור.
- להסיר את תמהיל הנוגדן ולבצע 3 שוטף עם 200 μL של PBS מארג כל לשטוף עבור 2 דקות. תנו למדגם להתייבש 5 דקות ולהגן עליו מפני האור. מקום 10 μL של פתרון הרכבה (טבלת חומרים) באזור התצהיר וכיסוי עם עטיפת מיקרוסקופ מבלי לעשות בועה. . אטום את הסרבל עם לק
6. רכישת תמונות אימונולווקורסנטי עם מיקרוסקופ פלורסנט ישר ותוכנות משויכות
- השתמש במיקרוסקופ פלורסנט ישר עם פלטפורמת ממונעת X/Y. השתמש במטרה 20x לקחת תמונות RGB 8-bit תמונה בארבעה ערוצים המתאימים לצבוע DNA (4 ', 6-diamidino-2-phénylineel), צבע PanCK (fluorescein isothiocyanate [FITC]), PD-L1 צבען (CY3), ו CD45 צבען (CY5). הפעל את מנורת הכספית 15 דקות לפני השימוש, ולהתאים את המיקרוסקופ ואת התוכנה המשויכת לירות למחצה יצרנית.
- הניחו את מגלשת הזכוכית על המשטח.
- בתפריט הרכישה, להגדיר את ארבעת הערוצים ולהגדיר את זמן החשיפה (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1,000 ms). להגדיר את האריחים כדי לסרוק. לחץ על אריחים. בניסוי מתקדם, הגדר את האזור לסריקה.
- כוונן את המוקד על המסך. לחץ על התחל ניסוי.
- יצא קובצי TIF של כל אחד מהערוצים ושמו במפורש את קובץ התמונה במידע זה: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. TIF (לדוגמה, Sample1_TR1_c1m01). צבע שמות כדלקמן: ערוץ DAPI הוא c1, ערוץ FITC הוא c2, CY3 ערוץ הוא c3, ו CY5 ערוץ הוא c4.
7. ניתוח תמונות של אימונולווקורדורף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה
- הורד והתקן את תוכנת ניתוח התמונה בחינם מהאתר של המכון הרחב. קבל את כל ברירת המחדל במהלך ההתקנה. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ולחץ על הקובץ | צינור מקובץ | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
הערה: קו הצינור ממיר תמונות צבע RGB לגווני אפור, מסיר פריטים באמצעות החלקת תמונות באמצעות מסנן חציון, מזהה גרעינים וציטופלסמה, מכמת את עוצמות הזריחה של כל אחד מהערוצים ומייצא אותם לקובץ excel. - שחרר קבצים ברשימת הקבצים. לעדכן את המטא-נתונים כדי לקבץ את הקבצים לפי אריחים.
הערה: כל ההוראות לקיבוץ תמונות מצוינות בתוכנה. קבצי שמות הופיעו ב Namesandtypes מודול וקבצים מקובצים בהתאם למספר האריח והערוץ לכל הדגימות. - לחץ על הצג הגדרות פלט וציין פלט ברירת מחדל נכון. לחץ על ניתוח תמונות. פתח את קובץ הגיליון האלקטרוני התואם לפרמטרי measure_intensity .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הראשון המחויבים היה להשיג מזוהם (ללא מדבקת סוכן) אוספים של CTCs לתרבות רקמות ולהימנע אם הרקע נוצר. פרוטוקול הטיהור איפשר ניקוי של כל הצינורות והמשאבות, והוא הביא את האוסף של CTCs עם שיעור התאוששות טובה ללא זיהום חיידקי. הדגימות המועשרת הושוו ללא ובעזרת תהליך הטיהור של התקן המיקרופלואידיג הספירלי. כדי לאמת את פרוטוקול הטיהור, קו התא A549 היה בשימוש העדר דם שלם מועשר ישירות באמצעות המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה. ללא פרוטוקול טיהור ממוטב, זיהום חיידקי גבוהה נצפתה בתרבות הרקמה של קו מועשר A549 cell לאחר רק 24 שעות, אשר גרם למוות שינויים בציטויום בתאי איקריוטית (איור 1B).
לעומת זאת, לאחר פרוטוקול הניקוי, החיים A549 תאים הושגו על ידי גידול בתרבות דו-ממדית לאחר 10 h של תרבות רקמות והסרת מדיה בתנאים תלת-ממדיים (איור 1B), כמו גם דגימות החולה (איור 1ג). CTC הפוטנציאלי מזוהים עם צלב אדום (איור 1ג).
איור 2 מסכם את זרימת העבודה המלאה לקבלת פנוטיפים מועשרים של CTCs מועשר מדם שלם. הוא מורכב מארבעה שלבים עיקריים: דגימת דם שלמה, העשרה CTC, immunofluorescence בדיקות (IF) וניתוח תמונה באמצעות תוכנה. בעבר, שיעור ההחלמה של המכשיר המיקרופלואידיג ספירלה טופלה14. באמצעות מחקה הפלורסנט CTCs (mCTC), זה שחזור שיעור הוקמה ב 1.3 CTCs/mL דם שלם14.
העבודה הנוכחית התמקדה בקביעת התנאים האופטימליים לניתוח IF של CTCs מועשר והדמיה במורד הזרם (איור 2). ראשית, כדי לבדוק את הספציפיות של הנוגדן PD-L1, שני קווי התא שימשו: (1) PC3-חיובית-חיוביות-PD-L1 קו התא ו-(2) SW620 נמוך-חיובי-PD-L1 קו התא. התאים היו אז מועשר עם המכשיר מיקרופלואידיג ספירלה ונותחו על ידי IF. כל התאים היו מוכתמים עם סמן נגד PanCK הגידול, תא דם לבן anti-CD45 סמן, anti-PD-L1 (שימושי בסרטן ריאות), ו DAPI (צבע גרעיני). תאי דם לבנים זוהו חיוביים עבור DAPI ו CD45, בעוד תאים סרטניים זוהו חיוביים עבור DAPI ו-PanCK ושלילי עבור CD45. קו התא PC3-PD-L1-חיוביים היה מוכתם באופן חיובי עבור PD-L1, בעוד הביטוי הנמוך ביותר של PD-L1 זוהה בקו הטלפון SW620-PD-L1-שלילי, הנמוכה ביותר.
לאחר מכן, השוו להלן: המנה (i) נוזל אם הצביעת (ii) כתמים של CTCs הופקד ישירות על שקופיות מצופות פוליליזין, ו (iii) אם כתמים של CTCs לאחר ציטוספין על שקופיות מצופות פוליליזין. הבחנו בבירור ששיעור ההחלמה של CTCs תלוי בסוג הפרוטוקול המשמש (איור 3א). בנוזל IF מכתים את הצורך, שיעור ההחלמה היה רק 10% עבור מספר הדוקרנים mCTC היה הנמוך ביותר. זה שיעור התאוששות נמוכה מציג בעיה עבור רוב המטופלים עם NSCLC גרורתי, כפי שהוא מגביל באופן משמעותי את היכולת של בדיקות אלה כדי לבודד את CTCs המעטים ולספק מידע פנוטימית. הסעיפים השני והשלישי תיאר (הפקדת ישירה של mCTC או CTC על שקופיות מצופה פולילייזין מבלי ועם cytopsin) בשיטתיות שיעורי התאוששות יעלה 60% (איור 3א).
איור 3 ב מראה תמונות מייצגות של אלה IF מאמר באמצעות דגימות דם שלמות מאותו החולה, או באמצעות נוזל אם מכתים את הטיפול או אם מכתים את הערך על שקופיות מצופות פוליליזין עם ציטוספין. ספירת הגרעינים הייתה שונה בבירור בין שתי הספרות (איור 3ב). כתמים DAPI גרעינית סיפק את הספירה של התאים הכולל במדגם, ואת מכתים סמנים מאופשר הדגשת הירוק התאים PanCK-חיוביים, כתום בתאי PD-L1-חיוביים, ואדום ב CD45 תאים לבנים שיורית (איור 3 B).
לאחר מכן, כדי להבדיל ציטווגית כדוריות הדם הלבנות מתאים מוסריים, הצורה של הגרעין צריך להיות דמיינו, שכן הוא מאפיין את סוג התא. איור 3 ג מדגים את קווי המתאר של הגרעינים, כי הם מטושטשים מורפולוגיה כי הוא יוצא דופן בהיעדר שלב ציטוספין. הפרוטוקול הממוטב כולל באופן זה ציטוטוויית של CTCs מועשר בשקופיות מצופות פוליליזין ולאחריה 4% הקיבעון הפרפורמלדהיד (בתחתית), לשמירה על השקופיות לפני כתמים. פרוטוקול ממוטב זה היה שיעורי התאוששות דומה התצהיר של mCTC ישירות על שקופיות מצופה polylysine (איור 3A), גם כאשר מעטים מאוד תאים נוספו. מאז צעד נוסף זה לאפשר שימור של מורפולוגיה גרעינית (איור 3ג), גרנולוציטים זוהו עם גרעיני multi-lobed שלהם, כמו גם תאים tumoral (מתויג עם צלב אדום בגרעין) עם הגרעין שלהם חריגות, דפוסי ממאירות, וגודל גדול יותר בהשוואה לתאי דם לבנים.
לאחר אופטימיזציה של פרוטוקול IF, הוכחה של קונספט נערך באמצעות דם שלם מחולים גרורתי. הדגימות נאספו באופן מבוסס במסגרת הקבוצה השגרתי של הארגון המבוסס על הבית חולים באוניברסיטת ליון. אוסף הדם בוצע בדרך כלל כאשר הרופאים הבחינו האינדיקציה המוקדמת של התקדמות הגידול. כל המקרים הגידול היו באופן היסטולוגית או באופן בוגי מאומת על דגימות ביופסיה FFPE במהלך האבחנה הראשונית. כאן, ניתוח CTCs במהלך התקדמות בוצעו על ידי חוקרים שלא היו להם גישה או ידע מראש של נתונים קליניים. שיקולים מפורטים מראש לפני הניתוח פורסמו בעבר15.
באיור 4, טבלה 1, וטבלה 2, ממצאים שונים מוצגים מדגימות המטופל. הפרופיל CD45 (+), PanCK (-), PD-L1 (-) מייצג את התאים החיסוניים. הספירה השיורית של כדוריות הדם הלבנות הוצגה בצורה מאוד משתנה ותלויה בדגימת הדם כולה. הטווח בקבוצה זו של טייס קטן היה 648-11000 לבן CD45 (+) תאים (איור 5א). כתוצאה מכך, מיד לאחר CTC העשרה, ספירה של התאים שנאספו נכלל כדי להתאים את הצפיפות התאית על אזור ציטוספין בצפיפות של 100,000 תאים/ציטוספין (ראה סעיף 6). זה מאופשר ביצועים של מספר ציטוסיבובים לחולה ואופטימיזציה של התבוננות מיקרוסקופית לספירה ידנית ושימוש בצינור התוכנה ניתוח התמונה.
באיור 4א-ג, טבלה 1ושולחן 2, מדווחים על מקרים שבהם ספירות תאי דם לבנים היו שונות מאוד:
(i) הפרופיל הראשון הוא CD45 (-), PanCK (+) ו-PD-L1 (+) המוצג באיור 4א . לעתים קרובות גודל התאים הוא מעולה 13 יקרומטר בקוטר ומורפולוגיה הגרעין אינו סדיר, המייצג דפוס ציטופולוגי של ממאירות. אוכלוסיה זו עשויה להיות מורכבת מ-CTC.
(ii) הפרופיל השני הוא CD45 (-), PanCK (-) ו-PD-L1 (+). כפי שכבר דווח, לא כל CTCs לבטא את ביונק הסמן (איור 4א).
(iii) הפרופיל השלישי הוא CD45 (-), PanCK (+) ו-PD-L1 (-). כפי שכבר דווח, לא כל CTCs לבטא את הL1.
(iv) הפרופיל הרביעי הוא CD45 (+), PanCK (+) ו-PD-L1 (+) המוצג באיור 4ב. הוא מייצג את התאים החיסוניים. הפעילים שאינם טיפוסי בדם אוכלוסייה זו תוארה במספר פרסומים16,17,18 , והיא מייצגת כ -5% מהתאים הכולל שלאחר העשרה. נוכחות של אוכלוסייה זו עשויה להגדיל את שיעור CTCs חיובי שווא במדגם אם האינטנסיביות של אות CD45 נמוך מדי מורפולוגיה של הגרעין אינו שימור היטב. זה מדגיש בחריפות את הצורך ביצוע כתמים משלימים מוסר מוסרי מוסרית, כגון Vimentin ו/או Epcam בתוך שיטת האימונולונציה זו.
(v) לבסוף, הפרופיל האחרון כולל את התאים הבלתי מסומנים CD45 (-), PanCK (-) ו-PD-L1 (-), המסומן באיור 4ג. הגרעין באוכלוסייה זו מציג לעתים קרובות דפוסים של ממאירות, והגודל הוא מעל 13 יקרומטר קוטר. אחוז התאים האלה בדגימות הוא משתנה מאוד בהתאם למטופל דם שלם. זה מדגיש את הצורך להשתמש בסמנים משלימים מוסריים כדי לאשר את דפוס מוסרי של משנה תא זה.
בטבלה 1 ובטבלה 2, הספירה לתא של 16 דגימות דווחה מהחולים מתקדמים nsclc גרורות. התאים סווגו לפי הביטוי של הסמנים. השתנות גבוהה נצפתה בתתי-אוכלוסיות שהתקבלו. כפי שדווח כבר במחקרים עצמאיים, CD45 (-), PanCK (+) ו-PD-L1 (+) נמצאו פרופילים ברוב הדגימות. עם זאת, כאשר אוכלוסיית הCTC מאוד הטרוגנית, דוגמאות למטופלים הכילו גם CD45 (-), PanCK (-), ו-PD-L1 (+) תת-אוכלוסיות, CD45 (-), PanCK (+), ו-PD-L1 (-) קבוצות משנה ותאים ללא תווית CD45 (-), PanCK (-) ו-PD-L1 (-) אוכלוסיות משנה. רמת השאריות של כדוריות הדם הלבנות הייתה משתנה במיוחד בקרב דגימות שנותחו.
כדי להקל על ספירת תאים, הוגדר קו צינור פיילוט באמצעות תוכנת ניתוח התמונה לניתוח אוטומטי של תמונות מערכת החיסונית. זרימת העבודה מתוארת באיור 5. במקרה זה, חשוב לרכוש תמונות immunofluorescence באיכות גבוהה במונחים של ניגודיות עוצמה פלואורסצנטית. בהתאם לקיבולת חישוב האשכול של החומרה, ניתן להחיל את צינור ניתוח התמונה על התמונה הממוזגת המלאה של הציטוספין או על אזור מייצג של הציטוספין.
כאן, בהתבסס על המיקרוסקופ, סריקה חצי אוטומטית של ציטוספין (X/Y; המוקד Z אינו כלול) שטח שנוצר 150-200 תמונות ממוזגות. ניתן למזג תמונות אלה יחד ולנתח באופן ישיר באמצעות צינור ניתוח התמונה. עם זאת, הליך זה הוא הזמן-והחישוב אשכול לצרוך משאבים, מגבלה חשובה לשימוש השגרתי שלה במעבדות. לכן, בהתבסס על ניסיון קודם בתחום של המטולוגיה תאית, הוחלט לנתח את האזורים הנציגים של כל מדגם לאחר אימות תחת מיקרוסקופ כי התפלגות התאים היה הומוגנית על האזור כולו של ציטוספין. אז, 25% מהשטח הכולל של ציטוספין (סביב 40 אריחים) נסרק עם מיקרוסקופ פלורנציה כדי לייצר 40 x 4 תמונות עצמאיות. הקובץ הממוזג פוצל באמצעות ערוצים, וקבצי תמונה נוצרו באופן אוטומטי עם תוכנת המיקרוסקופ (ראה סעיף 7; איור 5 A). קבצים אלה יובאו לתוך צינור ניתוח תמונה לניתוח בהתאם לפרמטרים המתוארים (ראה סעיף 8; איור 5 A).
באיור 5ב, זיהינו באופן ידני תמונה ייצוגית המציגה ארבעה CTCS [CD45 (-), panck (+), ו PD-L1 (+)] בין 77 תאים חיסוניים [CD45 (+), panck (-), ו-pd-L1 (-)]. איור 5 B מדגים כיצד תוכנת ניתוח התמונה זיהתה וספרה את מספר התאים המבוססים על צביעת dapi. הוא גם מדגים כיצד תוכנת ניתוח התמונה ספרה את האובייקטים המשניים. בסופו של דבר, דווחו על כל ערוצי פלורסנט עבור כל האובייקטים שדווחו בתמונות.
הרקע חושב ויוצג על-ידי התאים השליליים הנמצאים במדגם. לדוגמה, התאים החיסוניים שאינם מופעלים יש עוצמת זריחה נמוכה ואיפשר מדידת הרקע של PanCK ו-PD-L1 כתמים. האות הפלואורסצנט היה נחשב חיובית אם האינטנסיביות הפלואורסצנטית עלתה על זה של הרקע על ידי שני קיפול (מבוסס על ניתוח של ארבע דגימות המטופל עצמאית). בנוגע CD45 כתמים, כרמת הביטוי של CD45 הוא משתנה מאוד בתאי הדם הלבנים בתתי-אוכלוסיות, הסף של החיוביות הוגדר נמוך ככל האפשר. זה היה מבוסס על ניתוח של תמונות של 10 דם שלם בריא מוכתם עם הנוגדן CD45. ניתוח הפיילוט (n = 4) הראה הקונקורדנציה בין ספירה ידנית לבין ספירת תוכנות של ניתוח תמונה (טבלה 2). כל תא על הציטוספין מזוהה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ומאפשר לביולוגים לעקוב אחר התא ולאשר באופן ידני את התוצאות, במידת הצורך.
איור 1 : סקירה של זרימת העבודה עבור טיהור של מכשיר מיקרופלואידיג ספירלי כלי. (א) שלושה צעדים עיקריים הכלולים בתהליך הטיהור (ראה פרוטוקול), הממחישות את הלוקליזציה של הקלט והתפוקות של המכשיר. (ב) תמונות מייצגות של העשרת A549 התאים לפני ואחרי הטיהור של המכשיר. ההשפעה של נוכחות של סוכן זיהומיות על הכדאיות והמבנה של תאים שנאספו מוצג. בנוכחות חיידקים, המבנה התאי והכדאיות השתנו. סרגל בקנה מידה = 20 μm. (ג) 3d התרבות התא של דגימות החולה מועשר של ריאות, סרטן הערמונית, השד. הצלב האדום מתאים. לתאים לא-מסוימים סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : סקירה של זרימת העבודה של ניתוח immunofluorescence מדגימת דם שלמה לניתוח של תמונות הזריחה. השלבים העיקריים מוצגים כדלקמן: אוסף הדם עבור דם שלם, אוסף CTC עם מכשיר מיקרופלואידיג ספירלה, מנגנון האימונולואוורנציה, ותוכנות ניתוח תמונה. הבחירה של סמנים היה מונע על ידי זיהוי טוב יותר של אוכלוסיות שונות של תאים הנצפה על שקופית ציטוספין (CD45 עבור תאים חיסוניים, PanCK ו PD-L1 עבור תאים סרטניים בריאות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : שחזור שיעור של שלושה פרוטוקולים בעלי כתמים עצמאיים. (א) השוואה בין שיעור ההחלמה של mCTCs מפני כתמים נוזליים, כתמים ישירים של התא הופקד על שקופיות מצופות פוליליזין, וצביעת תאים לאחר ציטוספין על שקופיות מצופות פולייזין. (ב) תמונות מייצגות של דגימות מטופלים המעובדות על-ידי פרוטוקול IF נוזלי ופרוטוקול חיסוני ישיר עם הצעד ציטוספיל. תאים היו מוכתמים CD45 נוגדן חד שבטיים (שיבוט HI30) אלקסה Fluor 647; נוגדן חד שבטיים (שיבוט AE1/AE3) אלקסה Fluor 488; 4 ', 6-diamidino-2-לינידול (DAPI). סרגל בקנה מידה = 20 μm. (C) מייצגים תמונות של כתמים של ה-dapi של העשרה תאים עם וללא שלב ציטוספין. המבנה והגודל של הגרעינים הוכחו באמצעות צביעת DAPI. הצלב האדום מדגיש תאים עם חריגות בגרעין בתמונה הימנית. בתמונה השמאלית, התמונה מטושטשת, מכיוון שהתאים אינם נמצאים באותה רמה (x, y ו-z צירים). סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : זיהוי פרופילי תאים. (א) תמונות מייצגות של חולים עם פרופילי CTC שונים. ערוצי הקרינה הפלואורסצנטית מוצגים בנפרד. התמונות הממוזגות מוצגות בצד שמאל. הם מוכתמים CD45 נוגדן חד שבטיים (שיבוט HI30) אלקסה Fluor 647; נוגדן חד שבטיים (שיבוט AE1/AE3) אלקסה Fluor 488; PDL-1 נוגדן חד שבטיים (שיבוט 29E2A3) פיליקוארירין; 4 ', 6-diamidino-2-לינלידול (DAPI); חצים מצביעים על תאים לא מופיעים. (ב) דמויות מייצגות של כתמים חיסוניים של שתי דגימות מטופלים עם פרופילים של תאי דם לבנים הטיפוסי. תאים היו מוכתמים CD45 נוגדן חד שבטיים (שיבוט HI30) אלקסה Fluor 647; נוגדן חד שבטיים (שיבוט AE1/AE3) אלקסה Fluor 488; PDL-1 נוגדן חד שבטיים (שיבוט 29E2A3) פיליקוארירין; 4 ', 6-diamidino-2-לינידול (DAPI). התמונה מדגיש את נוכחותם של תאים חיסוניים מוכתם עם CD45 (+), PanCK (+), ו PD-L1 (+). (ג) התמונה מדגישה את הנוכחות של תאים ללא תווית (CD45 (-), panck (-) ו-PD-L1 (-). סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : מבט כולל על ניתוח של תמונות פלורסנט. (א) הצעדים העיקריים מתוארים: סריקת מיקרוסקופ, הערוץ מפוצל על פי הזריחה, וייבוא של קבצים לתוך תוכנת ניתוח תמונה. (ב) תיאור שלושת השלבים השונים עבור זרימת העבודה של תוכנת ניתוח התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: ספירה ידנית של העשרה תאים מטופלים. ספירת תאים בהתבסס על צביעת DAPI. ספירת אובייקטים אחרים המבוססים על FITC, PE ו-CY5 כתמים.
טבלה 2: תוכנת ניתוח תמונה ספירת העשרה תאים מטופלים . ספירת תאים בהתבסס על צביעת DAPI. ספירת אובייקטים אחרים המבוססים על FITC, PE ו-CY5 כתמים. השוואה בין ספירה ידנית וספירת תוכנות לניתוח תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שתי נקודות עיקריות גדלו במחקר הנוכחי, הראשון ביחס לביצועים של זרימת העבודה על העברתו ליישומים קליניים, והשני בנוגע לירידה בסובייקטיביות לניתוח של תמונות פלואורסצנטית שהתקבלו.
זרימת עבודה ממוטבת ומיטבית עבור ספירת CTC נקבעה בתחילה באמצעות שיטת IF הניתנת להתאמה אישית לאחר העשרת התאים באמצעות מערכת microfluidic מיקרופלומCTC ללא תווית (ספירלה התקן מיקרופלואידיג). באמצעות זרימת עבודה זו, מחקר פיילוט אישר כי כל הדגימות מהחולים NSCLC גרורתי הכיל תאים לא מסוימים, אשר היו כל CD45 (-). הם יכולים לחילופין להיות מתויג עם PanCK ו/או L1 בסמנים PD; עם זאת, הם יכולים גם להיות שליליים לחלוטין עבור כל מסמנים נבדק [CD45 (-), PanCK (-), ו-PD-L1 (-) כפי שנצפה במדגם S19 (טבלה 2)]. זה מדגיש בחוזקה את הצורך בסמנים נוספים עבור פנוטיפים CTC sub-אוכלוסיות. כתוצאה מכך, הוא הציע להוסיף אפיתל-mesenchymal ביואריטים כגון EpCAM, Vimentin, ו-N-קדהרין; סמנים של תאי גזע סרטן כולל CD44 ו CD133; סמנים סרטניים ספציפיים כולל TTF1 לריאות אדנוקרצינומה.
במחקר פיילוט, טווח של תא טיפוסי היה [40; > 400] מ 3.5 מ ל של דם שלם. , עבור 80% מדגימות החולה. ספירת התאים הלא-מטופלים הייתה מעל 50 אכן, בציטווגית19,20,21 דגימות מתוך אנדו בסימפונות אולטרה סוניק מדריך ברונכיט המחט השאיפה או CT-טרנס מודרך דקירות, PD-L1 ניתוח מתאים ביותר של דגימות, אבל הסף של ≥ 100 תאים סרטניים מאושפז בדרך כלל כדי לייצר פרשנות סטטיסטית וקלינית של הערך. עם זאת, במקרה מסוים של CTCs דם, יש לציין כי הנושא של טרוגניות הגידול המרחבי עקף בניגוד לדגימות קטנות באתר הגידול.
הנקודה השנייה הייתה למנוע את ההשפעה של המטפל בניתוח של התמונות האימונולואורתיים. תוכנת ניתוח תמונה של תמונות פלורסנט הוגדרה כך כדי לתקנן ספירת תאים ולספק נתונים סטטיסטיים עבור דגימות אלה. תהליך אוטומטי זה הדגיש את הצורך באשכולות חישוב רבי-עוצמה לניתוח של כל התאים המוכלים באותה דוגמית. בנוסף, איכות של הצביעת IF צריך להיות באותו מישור (כדי למנוע שימוש במערכות קונפוקלית וקד), ואת צפיפות התאים בתוך הציטוזה חייב להיות מכויל כדי לאפשר את תוכנת ניתוח התמונה כדי לזהות את כל התאים בנפרד בשקופית. לבסוף, התוצאות לא אומתו לגבי תוצאות קליניות בקבוצה של חולים, אבל נקודה זו יש להתייחס במחקר ייעודי אחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ז'אן-פיליפ Aurel ו קתרין Weiqi Li הם עובדים של חברת Biolidics אשר מייצרת מכשירים המשמשים במאמר זה. . לסופרים האחרים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר של אסטרצמקה (לונדון, הממלכה המאוחדת), ביולידיה (סינגפור) והסרטן ליגה לה (Saone et הלואר, צרפת). המחברים מודים לחברות אסטרסנקה וביולידיה על תמיכתם הכספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
