Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59873
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 4, 4, 5, 1, 3, 6,7, 1,2,3
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

Summary

Karakterisering av sirkulerende tumorceller (CTC) er et populært tema i translational forskning. Denne protokollen beskriver en semi-automatisk immunofluorescence (IF)-analysen for PD-L1 karakterisering og opplisting av CTC i ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) pasientprøver.

Abstract

Sirkulerende tumorceller (CTC) avledet fra den primære svulsten er utgytt i blodet eller lymfesystemet. Disse sjeldne cellene (1 − 10 celler per mL blod) garanterer en dårlig prognose og er korrelert med kortere total overlevelse i flere kreftformer (f.eks. bryst, prostata og tykk). Foreløpig er anti-EpCAM-belagt magnetisk perle-baserte CTC fange systemet gullstandarden test godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for opplisting CTC i blodet. Denne testen er basert på bruk av magnetiske perler belagt med anti-EpCAM markører, som spesifikt mål epitel kreftceller. Mange studier har illustrert at EpCAM ikke er den optimale markør for CTC deteksjon. Faktisk, CTC er en heterogen pasientpopulasjonen av kreftceller og er i stand til å gjennomgå en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) forbundet med metastatisk spredning og invasjon. Disse CTC er i stand til å redusere uttrykk for celle overflate epitel markør EpCAM, mens økende mesenchymal markører som vimentin. For å løse dette tekniske hinderet, har andre isolasjons metoder basert på fysiske egenskaper CTC blitt utviklet. Mikrovæskebasert teknologier muliggjør en etikett fri tilnærming til CTC-berikelse fra hele blodprøver. Spiral mikrovæskebasert teknologien bruker treghet og Dean drag krefter med kontinuerlig strømning i buede kanaler generert innenfor en spiral mikrovæskebasert chip. Cellene er separert basert på forskjellene i størrelse og plastisitet mellom normale blodceller og tumoral celler. Denne protokollen detaljer de ulike trinnene for å karakterisere den programmerte Death-ligand 1 (PD-L1) uttrykk for CTC, og kombinerer en spiral mikrovæskebasert enhet med passelig immunofluorescence (IF) markør sett.

Introduction

Tumor antigen-spesifikke cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) spiller en avgjørende rolle i responsen til kreft gjennom en prosess som kalles kreft "immun overvåking". Deres anti-tumor funksjoner forsterkes av immun kontrollpunkt blokade antistoffer som CTLA-4 hemmere og PD-1/PD-L1-hemmere. I ikke-liten celle lungekreft (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 terapier resultere i responsrater som spenner fra 0%-17% hos pasienter med PD-L1-negative svulster og 36%-100% i de uttrykker PD-L1. Den robuste responsen til PD-1/PD-L1-blokaden observert i melanom og NSCLC er vist ved tegn på bedret totalrespons rate (RR), holdbare kliniske fordeler, og progresjonsfri overlevelse (PFS). For tiden er anti-PD1 behandlinger standarden for behandling i andre linje NSCLC behandling med nivolumab uavhengig av PD-L1-uttrykk og med pembrolizumab hos pasienter som uttrykker PD-L1 ≥ 1%. I første-linje behandling er standard for pleie pembrolizumab alene hos pasienter med NSCLC som uttrykker PD-L1 ≥ 50% og kan potensielt forbedres med kjemoterapi (Platin og doublet legemiddel avhengig av histologic under type)1,2.

Imidlertid er en slik tilnærming til pasientbehandling diskuteres3, siden PD-L1 uttrykk i tumorceller ved IMMUNHISTOKJEMI (IHC) er trolig ikke den mest ideelle følgesvenn biomarkør. Andre som tumor mutasjon byrde4 (TMB), mikrosatellittmarkør ustabilitet (MSI), og/eller bakterieflora er muligens interessant i denne innstillingen enten alene eller i kombinasjon. NSCLC er kjent for å være heterogene svulster, enten romlig (fra en svulst området til en annen) eller timelig (fra diagnose til gjentakelse). Pasienter med NSCLC er vanligvis skjøre, og repeterende invasiv vev biopsier kan være et problem. Faktisk, re-biopsi rate ved første progresjon varierer fra 46%-84% avhengig av serien, og vellykket re-biopsi (som betyr med histologiske og full molekylær analyse) spenner fra 33%-75%. Dette betyr at 25%-67% av pasientene ikke kan motta en omfattende re-biopsi analyse under første progresjon5,6,7,8.

Ankomsten av "flytende biopsier" har dermed generert betydelig entusiasme i denne spesielle innstillingen, da det muliggjør avgjørende revurdering av molekylær endringer under sykdomsprogresjon ved å undersøke sirkulerende gratis DNA (cfDNA) avledet fra sirkulerende tumorceller (CTC). Disse levende celler frigjøres fra svulsten inn i blodet, der de sirkulerer fritt. Selv om det ikke rutinemessig brukes, analyse av CTC synes å være svært lovende i tilfelle av molekylær og fenotypiske karakterisering, prognose, og prediktiv betydning i lungekreft (via DNAseq, RNAseq, miRNA og proteinanalyse). Faktisk, CTC sannsynlig Harbor fenotypiske karakteristikker av den aktive sykdommen i stedet for den første markører (påvist på vev biopsier ved diagnose). Videre CTC omgå problemet med romlig heterogenitet av tumor vev, som kan være en avgjørende sak i små biopsier. Følgelig kan PD-L1-uttrykk på CTC potensielt kaste lys over avvikene avledet fra bruken som en prediktiv biomarkør ved hjelp av tumor vev.

Nylig har PD-L1-uttrykket blitt testet i CTC av NSCLC. Nesten alle pasientene testet9 var PD-L1-positive, kompliserer tolkningen av resultatet og dens klinisk bruk. Samlet, PD-L1-positive CTC ble påvist i 69,4% av prøvene fra et gjennomsnitt på 4,5 celler/mL10. Etter initiering av strålebehandling, andelen av PD-L1-positive CTC økt betydelig, noe som indikerer oppregulering av PD-L1 uttrykk som svar på stråling11. Derfor kan PD-L1 CTC analyse brukes til å overvåke dynamiske endringer av tumor og immunrespons, som kan gjenspeile responsen til kjemoterapi, stråling, og sannsynlige immunterapi (IT) behandlinger.

Hittil CTC isolasjon og PD-L1 karakterisering stole på ulike metoder som anti-EpCAM-belagt magnetisk perle-baserte CTC fange, berikelse-Free basert analysen, og størrelse-basert12,13 CTC fangst analyser. Imidlertid ble CTC bare påvist i 45%-65% av pasientene med metastatisk NSCLC, og dermed begrense deres evne til å gi informasjon for mer enn halvparten av metastatisk NSCLC-pasienter. I tillegg var CTC-tellingen lav i de fleste av disse studiene ved hjelp av størrelsesbasert tilnærming10. Videre har denne metoden ført til uoverensstemmelser som påvisning av CD45 (-)/DAPI (+) celler med "cytomorphological mønstre av kreft" i blodet av sunne donorer. Disse bekymringene fremhever behovet for en svært følsom metode for CTC-kolleksjon forbundet med immun-bestemmelse av fenotype av atypiske CD45 (-) celler fra sunt hele blod ved hjelp av ekstra kreft biomarkører (dvs. TTF1, vimentin, EpCAM og CD44) i NSCLC.

Følgelig evaluerte vi en spiral mikrovæskebasert enhet som bruker treghet og Dean dra styrker til separate celler basert på størrelse og plastisitet gjennom en mikrovæskebasert chip. Dannelsen av Dean Vortex renn til stede i mikrovæskebasert chip resulterer i større CTC plassert langs den indre veggen og mindre immunceller langs ytterveggen av brikken. Den berikelse prosessen er fullført ved siphoning de større cellene i samlingen uttaket som beriket CTC brøk. Denne metoden er spesielt følsom og spesifikk (påvisning av rundt 1 CTC/mL av hele blod)14 og kan knyttes til tilpassede IMMUNOFLUORESCENCE (IF)-analyser. Disse verktøyene vil gjøre det mulig å sette opp en positiv terskel for klinisk tolkning. En arbeidsflyt er således beskrevet som gjør det mulig for biologer å isolere og immunophenotype CTC med høy grad av restitusjon og spesifisitet. Protokollen beskriver optimal bruk av spiral mikrovæskebasert enheten for å samle CTC, den optimaliserte IF-analysene som kan tilpasses etter krefttype, og bruk av gratis åpen kilde-programvare for å måle og analysere celle bilder for å utføre en halvautomatisk numeration av cellene i henhold til fluorescerende flekker. I tillegg kan mikroskop multipleksing utføres avhengig av antall fluorescerende filtre/markører tilgjengelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prøvene ble prospektivt samlet innenfor rammen av CIRCAN ("sirkulerende kreft") kohort basert ved Lyon universitetssykehus etter pasientens skriftlige samtykke. Denne studien ble integrert i CIRCAN_ALL-kohort. Studien CIRCAN_ALL ble anerkjent som ikke-interventional av CPP South-East IV datert 04/11/2015 under referanse L15-188. En endret versjon ble anerkjent som ikke-interventional på 20/09/2016 under henvisning L16-160. Den CIRCAN_ALL studien ble erklært til IT og frihets korrespondent for Hospices civils de Lyon på 01/12/2015, under referanse 15-131. Blood samlingen ble utført når leger observert den tidligste indikasjon på tumorprogresjon.

Merk: Bruk alle reagensene og materialene som er skissert i innholdsfortegnelsen , med de respektive lagrings betingelsene for Forhåndsanalyse av prøve forberedelser og immunofluorescence analysen. Hvis du erstatter reagenser og/eller endrer lagringsforhold, kan det føre til suboptimal analyse ytelse.

1. rensing av spiral Mikrovæskebasert enhet

Merk: Rensing av spiral mikrovæskebasert enheten er et krav for å fjerne alle immunofluorescence bakgrunn generert fra bakterier forurensning, utforske cytomorphology av CTC, og være i stand til å skille dem fra normale immunceller. Protokollen er optimalisert for blodprøver samlet i K2EDTA rør innen 6 h etter blodprøve og beriket med spiral mikrovæskebasert enheten i rene forhold. Ved hjelp av denne analysen for andre typer prøver (andre biologiske væsker) kan kreve ekstra optimalisering. Denne rense protokollen bør gjøres en gang per uke.

  1. Tilberedning av reagenser
    1. Tilberedning av fortynnings bufferen
      1. Sterilisere 20 mL fortynningsmiddel for væske ved hjelp av et sprøyte filter på 0,22 μm og Legg direkte til 1 liter 1x fosfat buffer saltvann (PBS) Ultra-ren karakter (tabell over materialer).
    2. Sterilisering av reagenser og inngangs strå
      1. Sterilisere RBC lyse buffer og blanding buffer (RSB; Tabell med materialer) ved hjelp av et sprøyte filter på 0,22 μm og lager i et nytt 50 mL polypropylen konisk rør for hver løsning.
      2. Sterilisere inngangs strå ved incubating ved romtemperatur (RT) for 1 time i Universal rengjørings reagens (tabell av materialer). Overfør halm til blekemiddel (materialfortegnelsen) og RUGE ved RT for 1 time.
      3. Skyll inngangs strå to ganger med steril PBS for 1 time hver, og oppbevar det steriliseres inngangs strå i en kirurgisk steril pose (tabell med materialer).
  2. Decontaminating spiral mikrovæskebasert enheten
    1. Desinfeksjon med Universal rengjørings reagens
      1. Koble fortynnings flaskekorken fra fortynnings porten på spiral mikrovæskebasert enheten ved å skru den brune skruen. Under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett kan du overføre opptil 250 mL av Universal rengjørings reagens (tabell av materialer) til en ny, tom flaske.
      2. Skru flaskekorken og halm til flasken med 250 mL Universal rengjørings reagens under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett. Fest denne flasken til fortynnings porten av spiral mikrovæskebasert enheten ved å skru tilbake den brune skruen.
      3. Overføring opp til 100 mL blekemiddel (1% endelig konsentrasjon; Tabell med materialer) avfallsbeholderen som følger med løpe settet (figur 1A).
      4. Legg en ny steril input halm på spiral mikrovæskebasert enheten (tabell over materialer) i inngangsporten. Sett inn et nytt 50 mL sentrifugerør i inngangsporten. Legg et nytt 50 mL sentrifugerør i utgangsporten.
      5. Fortsett å prime spiral mikrovæskebasert enheten ved å klikke på Prime på spiral mikrovæskebasert enhet (3 min). Fjern inngangs røret etter at Prime er fullført.
      6. Overfør opptil 15 mL Universal rengjørings reagens til et nytt 50 mL sentrifugerør med en serologisk pipette under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett og fest slangen til inngangsporten på spiral mikrovæskebasert enheten.
      7. Før du starter kjøringen, kontroller at oppløsningen er fri for store bobler. Hvis det finnes bobler, fjerner du dem ved å ta et langsomt aspirasjon med en pipette.
      8. Legg en rense mikrovæskebasert chip i spiral mikrovæskebasert enheten. Kjør et program 3 på spiral mikrovæskebasert enheten ved å klikke på Kjør og velge programmet 3 (31 min).
        Merk: program 3 av spiral mikrovæskebasert enhet muliggjør en rask berikelse av CTC i 31 min.
      9. Fortsett med spiral mikrovæskebasert rengjørings trinn ved hjelp av gjenværende volum av Universal rengjørings reagens i inngangs røret.
      10. Kast inngangs røret etter at rengjøringstrinnet er ferdig, og la det være igjen bak inntaket.
    2. Rensing ved hjelp av Bleach-baserte rengjøringsmiddel
      1. Koble fra Universal rengjørings reagens korken fra fortynnings porten på spiral mikrovæskebasert enheten ved å skru den brune skruen. Under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett kan du overføre opptil 250 mL blekemiddel BAS ert rengjøringsmiddel (tabell over materialer) i en ny, tom flaske (figur 1a).
      2. Skru den universalrengjøringsmiddel flasken og halm til flasken som inneholder Bleach-baserte rengjøringsmiddelet under en mikrobiologisk sikkerhetskabinett. Fest denne flasken til fortynnings porten av spiral mikrovæskebasert enheten ved å skru tilbake den brune skruen.
      3. Overfør opptil 15 mL bleke BAS ert rengjøringsmiddel til et nytt 50 mL sentrifugerør med en serologisk pipette under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett. Sett inn den 50 mL sentrifuge slangen. Legg et tomt rør i utgangsstilling.
      4. Før du behandler kjøringen, bør du kontrollere at prøven er fri for store bobler, og om noen er til stede, fjerner du boblene ved å aspirating dem langsomt med en pipette.
      5. Kjør program 3 ved å klikke på Kjør og velge programmet 3 (31 min). Etter kjøringen går du direkte til rengjøringstrinnet ved hjelp av det gjenværende volumet av blekemiddel BAS ert rengjøringsmiddel i inngangs røret.
      6. Kast inn-og utgangs rørene.
    3. Skyll spiral mikrovæskebasert heten.
      1. Koble den bleke BAS ert rengjøringsmiddel flaskekorken fra fortynnings porten på spiral mikrovæskebasert enheten ved å skru den brune skruen. Under en mikrobiologisk sikkerhetskabinett, overføre halm fra flasken som inneholder blekemiddel-basert rengjøringsmiddel til den nye flasken som inneholder fortynningsmiddel buffer. Skru flasken til spiral mikrovæskebasert enheten.
      2. Overfør opp til 15 mL sterilisert vann (materialfortegnelsen) til et nytt 50 ml sentrifugerør med en serologisk pipette under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett. Sett inn den 50 mL sentrifuge slangen. Legg et tomt rør i utgangsstilling.
      3. Før du behandler kjøringen, bør du kontrollere at prøven er fri for store bobler, og om noen er til stede, fjerner du boblene ved å aspirating dem langsomt med en pipette.
      4. Kjør program 3 ved å klikke på Kjør og velge programmet 3 (31 min). Etter kjøringen går du direkte til rengjøringstrinnet ved hjelp av det gjenværende volumet av sterilisert vann i inngangs røret.
      5. Kast inn-og utgangs rørene.

2. vedlikehold for å holde spiral Mikrovæskebasert enheten bakterier-gratis

Merk: Rutinemessig vedlikehold bør gjøres på slutten av dagen under siste rengjøring trinn.

  1. Overfør opptil 7 mL bleke BAS ert rengjøringsmiddel til det nye 50 mL sentrifuge røret ved hjelp av en serologisk pipette under en mikrobiologisk sikkerhetskabinett. Skru blekemiddel BAS ert rense røret i inngangsporten på spiral mikrovæskebasert enheten.
  2. Før du behandler det rene løpeturen, kontrollerer du at inn data prøven er fri for store bobler, og hvis noen er til stede, fjerner du boblene ved å aspirating dem langsomt med en pipette.
  3. Kjør ren på spiral mikrovæskebasert enheten.

3. pre-analytisk berikelse av CTC fra pasient blodprøver

  1. Samle 7,5 mL blod i K2EDTA tube og holde under milde agitasjon for å unngå celle sedimentering og blodpropp. Prosess innen 6 timer.
    Merk: Hvis blodet samles i et celle fritt DNA-blodprøvetakingsrør som inneholder konserveringsmiddel, oppbevares ved 4 ° c til behandlingen. Kontroller at Blodprøven, RBC lyseringsbufferen og RBS-bufferen er på RT før du fortsetter med den berikelse trinn.
  2. Overfør opptil 7,5 mL hele blod til et nytt 50 mL sentrifugerør med en serologisk pipette under et mikrobiologisk sikkerhetskabinett.
  3. Sentrifuger på 1 600 x g for 10 min ved RT. samle inn plasma brøk med en pipette uten å forstyrre Buffy coat. Erstatt plasma fraksjonen ved å legge direkte tilsvarende volum av PBS opp til 7,5 mL.
  4. Legg forsiktig til RBC lyse buffer (tabell av materialer) til blodprøve til et endelig volum på 30 ml (for en K2EDTA tube) eller 37,5 ml (for en celle-fri DNA blodprøvetakingsrør). Inverter blodprøvetakings slangen 10x og ruge i 10 minutter ved RT.
    Merk: Blodprøven blir mørkere rødt under RBC lyse. Hvis ingen endring (fra mørk rød og ugjennomsiktig) er observert etter 10 min, forsiktig invertere røret 3x og la det stå for ytterligere 5 min maksimum. Ikke la prøven i RBC lyseringsbuffer i mer enn 15 min fordi det kan kompromittere prøven kvalitet og analysen ytelse.
  5. Sentrifuger den lysert blodprøve på 500 x g for 10 min ved RT, med sentrifuge bremser på (eller høyeste retardasjon hastighet). Bruk en pipette med Pasteur eller en serologisk pipette for å fjerne supernatanten forsiktig til volumet når 4-5 mL-merket. Deretter bruker du filtrerte micropipette tips for å fjerne de resterende supernatanten.
  6. Bruk en P1000-micropipette med et filtrert tips, tilsett 1,0 mL RSB på veggen til 50 mL sentrifuge slange inn data rør. For å unngå å innføre bobler i miksen, resuspend celle pellet ved å forsiktig pipettering opp og ned til prøven er homogen.
  7. Legg ytterligere 3 mL RSB til veggen i 50 mL sentrifugerør inngangsrør (totalt volum 4 mL). Unngå å innføre bobler i miksen. Bland forsiktig celle fjæringen ved å pipettering forsiktig opp og ned.
    Merk: I det usannsynlige tilfellet at vanlige pipettering ikke klarer å bryte ned celle klumper (definert ved å være synlig eller blokkere pipette spissen), filtrerer prøven gjennom en 40 μm celle sil for å fjerne eventuelle klumper. Tilsett 150 μL av RSB i prøven for å gjøre opp for volum tap fra filtrering. Merk at denne metoden skal brukes sparsomt og bare når store klumper er observert.
  8. Før du går videre til berikelse trinnet, sjekk at prøven er fri for overdreven bobler og hvis noen er til stede, fjerne bobler og ta vare ikke å forkaste noen prøve. Hvis små bobler er til stede, er deres fjerning ikke nødvendig.
  9. Behandle prøven på spiral mikrovæskebasert enheten.

4. berikelse av CTC fra pasient hele blod med spiral Mikrovæskebasert Device

  1. Legg en ny spiral mikrovæskebasert chip. Legg to tomme 50 mL sentrifugerør i inngangs-og utgangs porter.
  2. Kjør en Prime ved å klikke på Prime på spiral mikrovæskebasert enheten (3 min). Fjern input og output rør og laste prøven skal behandles i inngang port.
  3. Legg en klar 15 mL konisk rør i utgangsporten for å samle beriket CTC. Kjør program 3 ved å klikke på Kjør og velge programmet 3 (31 min).
  4. Losse utgangsslangen og sentrifuge ved 500 x g i 10 min (akselerasjon: 9; retardasjon: 5). med en 5 ml serologisk pipette, Fjern supernatanten stopper ved 2 ml merket på det koniske 15 ml røret. Med en micropipette, Fjern supernatanten som stopper ved 100 μL-merke på det koniske 15 mL røret. Behandle beriket prøven direkte for immunofluorescence farging.

5. Immunofluorescence farging

  1. Nummerer et kamret lysbilde med et hemocytometer antall celler per mL. Fortynne den beriket prøven med 0,2% anti-bindende løsning (tabell av materialer) til en konsentrasjon som når 100 000 celler/100 μL per cytospin.
  2. Fukt konturen av prøvekammeret ved hjelp av bomull (materialfortegnelsen) med 50 μL av 0,2% anti-bindende løsning. Plasser en polylysine glass-Skyv i prøvekammeret og Lukk.
  3. Coat et tips med 0,2% anti-bindende løsning ved pipettering opp og ned 3x. Resuspend den beriket prøven og Overfør celle løsningen inn i prøvekammeret. Sentrifuger med en dedikert sentrifuge (tabell av materialer) ved 400 RPM for 4 min (akselerasjon lav).
  4. Plasser en silisium isolator rundt området deponering. La tørke glass-Slide under en mikrobiologisk sikkerhetskabinett i 2 min.
  5. Klargjør fikserings løsningen ved å fortynne 1 mL 16% paraformaldehyde (PFA) med 3 mL sterilt PBS. Tilsett 100 μL av fikserings løsning (4% PFA) per prøve og ruge ved RT i 10 min. Fjern fikserings løsningen og utfør tre vasker med 200 μL av PBS og ruge ved RT hver for 2 min.
    Forsiktig: Bruk PFA under en kjemisk sikkerhetskabinett for å hindre innånding.
  6. Forbered metning løsning ved å fortynne fosterets storfe serum (FBS) ved 5%, FC reseptor (FcR) blokkerer reagens ved 5%, og storfe serum albumin (BSA) på 1% i steril PBS (tabell av materialer). Tilsett 100 μL av metnings oppløsning per prøve og ruge i 30 minutter ved RT. Fjern metnings løsning.
  7. Tilsett 100 μL av antistoff oppløsning per prøve (CD45 antistoff 1/20; PanCK antistoff 1/500; PD-L1-antistoff 1/200; Qsp metning løsning 100 μL) (tabell av materialer). Plasser polylysine glass-Slide i en 100 mm x 15 mm Petri parabolen. Fukt et absorberende papir med 2 mL sterilt vann og Lukk Petri-parabolen med lokket. Plasser ved 4 ° c over natten og Beskytt mot lyset.
  8. Fjern antistoff blandingen og utfør 3 vask med 200 μL av PBS incubating hver vask i 2 min. La prøven tørke i 5 minutter og Beskytt den mot lyset. Plasser 10 μL av monteringsløsning (tabell av materialer) i området deponering og dekk med et mikroskop dekkglass uten å lage en boble. Forsegle dekkglass med neglelakk.

6. oppkjøp av Immunofluorescent bilder med Straight fluorescerende mikroskop og tilhørende programvare

  1. Bruk et rett fluorescerende mikroskop med en X/Y-motorisert plattform. Bruk en 20x mål å ta 8-bits RGB TIFF-bilder i fire kanaler tilsvarende DNA fargestoff (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK Dye (fluorescein isothiocyanate [FITC]), PD-L1 Dye (CY3), og CD45 Dye (CY5). Slå på kvikksølvlampe 15 min før bruk, og tilpasse mikroskopet og tilhørende programvare til semi-automatisert skyte.
  2. Plasser glass-Slide på plattformen.
  3. I oppkjøpet menyen, definere de fire kanalene og sette opp eksponeringstid (DAPI: 15 MS, FITC [PanCK]: 500 MS; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1 000 MS). Definer flisene som skal skannes. Klikk på fliser. Definer området du vil skanne, i Avansert eksperiment.
  4. Juster fokuset på skjermen. Klikk Start eksperimentet.
  5. Eksporter TIF-filer for hver kanal og spesifikt navn bildefilen med denne informasjonen: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. tif (f. eks, Sample1_TR1_c1m01). Navn fargestoff som følger: DAPI kanalen er C1, FITC kanal er C2, CY3 kanal er C3, og CY5 kanal er C4.

7. analyse av Immunofluorescent bilder med bildeanalyse programvare

  1. Last ned og Installer gratis bildeanalyse programvare fra Broad Institute nettsted. Godta alle standardinnstillingene under installasjonen. Åpne bildeanalyse programvaren og klikk på fil | Rørledning fra fil | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
    Merk: Rørledningen konverterer RGB fargebilder til gråtoner, fjerner artefakter ved å jevne ut bilder med et median filter, identifiserer kjerner og cytoplasma, kvantifiserer fluorescens intensitet for hver kanal, og eksporterer dem til en Excel-fil.
  2. Slipp filer i fillisten. Oppdater metadataene for å gruppere filene etter fliser.
    Merk: Alle instruksjonene for å gruppere bilder er angitt i programvaren. Navn filer dukket opp i NamesAndTypes modul og filer er gruppert i henhold til antall flisen og kanal per prøver.
  3. Klikk Vis utdata-innstillinger , og angi riktig standard utdata. Klikk på analyser bilder. Åpne regnearkfilen som tilsvarer measure_intensity -parametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den første forutsetning var å få uforurenset (smittsomme agent-Free) samlinger av CTC for vev kultur og unngå IF bakgrunn generert. Rense protokollen aktivert rengjøring av alle rør og pumper, og det resulterte i innsamling av CTC med en god utvinningsgrad uten bakteriell forurensning. De beriket prøvene ble sammenlignet uten og med rensing protokollen arbeidsflyten av spiral mikrovæskebasert enheten. For å validere rense protokollen, A549 cellelinjen ble brukt i fravær av hele blod og beriket direkte ved hjelp av spiral mikrovæskebasert enheten. Uten optimalisert rensing protokollen, høy bakteriell forurensning ble observert i vevet kulturen beriket A549 cellelinje etter bare 24 h, som forårsaket død og cytomorphological endringer i eukaryote celler (figur 1B).

I kontrast, etter rensing protokollen, levende A549 celler ble oppnådd ved å vokse i 2D-kultur etter 10 h av vev kultur og Media fjerning og i 3D-forhold (figur 1B), samt pasientprøver (figur 1C). Potensielle CTC identifiseres med et rødt kryss (figur 1C).

Figur 2 viser den komplette arbeidsflyten for immunofluorescence bestemmelse av fenotype av beriket CTC fra hele blod. Det består av fire store skritt: hele blodprøve, CTC berikelse, immunofluorescence (IF)-analysen, og bildeanalyse ved hjelp av programvare. Tidligere har utvinningsgraden av spiral mikrovæskebasert enheten blitt adressert14. Ved hjelp av fluorescerende etterligne CTC (mCTC), ble denne utvinningsgraden etablert på 1,3 CTC/mL hele blodet14.

Den nåværende arbeid fokusert på å sette opp optimale forhold for IF-analyse av beriket CTC og nedstrøms visualisering (figur 2). Først, for å teste spesifisitet av PD-L1-antistoff, ble to cellelinjer brukt: (1) PC3 High-positive-PD-L1-cellelinje og (2) SW620 Low-positive-PD-L1 cellelinje. Cellene ble deretter beriket med spiral mikrovæskebasert enheten og analysert av IF. Alle celler ble farget med svulsten anti-PanCK markør, hvite blodlegemer anti-CD45 markør, anti-PD-L1 (nyttig i lungekreft), og DAPI (kjernefysisk fargestoff). Hvite blodlegemer ble identifisert som positive for DAPI og CD45, mens kreftceller ble identifisert som positive for DAPI og PanCK og negative for CD45. Den PC3 High-PD-L1-positive cellelinjen var positivt farget for PD-L1, mens en lavere PD-L1-uttrykket ble oppdaget i SW620 Low-PD-L1-negative cellelinje.

Deretter ble følgende sammenlignet: (i) flytende IF farging analysen, (II) farging av CTC direkte avsatt på polylysine-belagte lysbilder, og (III) hvis farging av CTC etter cytospin på polylysine-belagte lysbilder. Det ble klart observert at utvinningsgraden av CTC avhengig av hvilken protokoll som brukes (Figur 3A). I væsken hvis farging analysen, var utvinningsgraden bare 10% for antall piggete mCTC var den laveste. Denne lave utvinningsgraden presenterer et problem for de fleste pasienter med metastatisk NSCLC, da det i betydelig grad begrenser muligheten for disse testene til å isolere de få CTC og gi fenotypiske informasjon. Den andre og tredje delen beskrevet (direkte deponering av mCTC eller CTC på polylysine-belagte lysbilder uten og med cytopsin) systematisk hadde utvinningsgrad overstiger 60% (Figur 3A).

Figur 3 B viser representative bilder av disse IF-analysene som bruker hele blodprøver fra samme pasient, enten ved bruk av væsken hvis Fargeanalysen eller hvis Fargeanalysen på polylysine-belagte lysbilder med cytospin. Den opplisting av kjerner var klart forskjellig mellom de to analysene (Figur 3B). Den kjernefysiske DAPI farging gitt opplisting av totalt celler i utvalget, og biomarkør farging aktivert utheving av de grønne PanCK-positive celler, oransje i PD-L1-positive celler, og rødt i CD45 gjenværende hvite celler (Figur 3 B).

Deretter, for å cytologisk skille hvite blodlegemer fra tumoral celler, har formen på kjernen til å bli visualisere, siden det er karakteristisk for celletypen. Figur 3 C demonstrerer konturene av kjerner som er uklare og morfologi som er uvanlig i fravær av cytospin trinn. Den optimaliserte protokollen inkluderte således cytospinning av beriket CTC på polylysine-belagte lysbilder etterfulgt av 4% paraformaldehyde (PFA) fiksering, for å bevare lysbildene før IF farging. Denne optimaliserte protokollen hadde lignende utvinningsgrad som deponering av mCTC direkte på polylysine-belagte lysbilder (Figur 3A), selv når svært få celler ble lagt til. Siden dette ekstra trinnet aktivere bevaring av kjernefysisk morfologi (Figur 3C), granulocytter ble identifisert med sine multi-flikete kjerner, samt tumoral celler (merket med et rødt kryss i kjernen) med sine kjernefysiske unormalt, kreft mønstre, og større størrelse sammenlignet med hvite blodlegemer.

Etter optimalisering av IF-protokollen, en proof-of-konseptet ble utført ved hjelp av hele blod fra metastatisk pasienter. Prøvene ble prospektivt samlet innenfor rammene av CIRCAN rutine kohort basert ved Lyon universitetssykehus. Blood samling ble vanligvis utført når leger observert den tidligste indikasjon på tumorprogresjon. Alle tumor tilfeller ble histologisk eller cytologisk bekreftet på FFPE biopsi prøver under den første diagnosen. Her, CTC analyser på progresjon ble utført av etterforskere som ikke har tilgang til eller tidligere kunnskap om kliniske data. Detaljert pre-analytisk hensyn ha blitt tidligere offentliggjort15.

I Figur 4, tabell 1og tabell 2presenteres forskjellige funn fra pasientprøvene. Den CD45 (+), PanCK (-), PD-L1 (-) profil representerer immunceller. Det resterende antallet hvite blodceller ble vist å være sterkt variabel og avhengig av hele Blodprøven. Utvalget i denne lille piloten kohort var 648-11000 hvite CD45 (+) celler (figur 5A). Følgelig, umiddelbart etter CTC-berikelse, ble det inkludert en opplisting av de innsamlede cellene for å justere celle tettheten på cytospin området ved en tetthet på 100 000 celler/cytospin (se pkt. 6). Denne aktiverte utførelsen av flere cytospins per pasient og optimalisering av mikroskopisk observasjon for manuell opplisting og bruk av bildeanalyse programvare rørledning.

I Figur 4A-C, tabell 1og tabell 2rapporteres typiske tilfeller der gjenværende antall hvite blodlegemer var svært forskjellige:

(i) den første profilen er CD45 (-), PanCK (+) og PD-L1 (+) presentert i Figur 4A . Ofte størrelsen på cellene er overlegen 13 μm i diameter og kjernen morfologi er uregelmessig, som representerer en cytomorphological mønster av kreft. Denne populasjonen består sannsynligvis av CTC.
(II) den andre profilen er CD45 (-), PanCK (-) og PD-L1 (+). Som allerede rapportert, ikke alle CTC uttrykke PanCK biomarkør (Figur 4A).
(III) den tredje profilen er CD45 (-), PanCK (+), og PD-L1 (-). Som allerede rapportert, ikke alle CTC uttrykke PD-L1-biomarkør.
(IV) den fjerde profilen er CD45 (+), PanCK (+) og PD-L1 (+) presentert i Figur 4B. Det representerer atypiske aktiverte immunceller i pasientens hele blod. Denne populasjonen har blitt beskrevet i flere publikasjoner16,17,18 og representerer ca 5% av de totale cellene etter berikelse. Tilstedeværelsen av denne populasjonen kan øke frekvensen av falske positive CTC i en prøve hvis intensiteten av CD45 signalet er for lavt og morfologi av kjernen er ikke godt bevart. Dette fremhever sterkt behovet for å gjennomføre komplementære tumoral biomarkør farging, slik som vimentin og/eller Epcam i denne immunofluorescence analysen.
(v) til slutt, den siste profilen inneholder umerkede cellene CD45 (-), PanCK (-), og PD-L1 (-), uthevet i Figur 4C. Kjernen i denne populasjonen viser ofte cytomorphological mønstre av kreft, og størrelsen er over 13 μm i diameter. Prosentandelen av disse cellene i prøvene er svært variabel i henhold til pasientens hele blod. Dette understreker behovet for å bruke komplementære tumoral biomarkører å bekrefte tumoral mønster av denne cellen sub-befolkningen.

I tabell 1 og tabell 2 ble celle tellingen 16 prøver rapportert fra avanserte metastatisk NSCLC-pasienter. Cellene ble klassifisert i henhold til uttrykket av biomarkører. Det ble observert høy variasjon i under gruppene som ble innhentet. Som allerede rapportert i selvstendige studier, CD45 (-), PanCK (+) og PD-L1 (+) profiler ble funnet i de fleste prøvene. Likevel, ettersom CTC-populasjonen er svært heterogen, inneholdt pasientprøvene også CD45 (-), PanCK (-), og PD-L1 (+) Sub-populasjoner, CD45 (-), PanCK (+), og PD-L1 (-) Sub-populasjoner og umerkede celler CD45 (-), PanCK (-), og PD-L1 (-) under populasjoner. Nivået av gjenværende hvite blodlegemer var svært variabel blant analyserte prøver.

For å lette celle opplisting ble en pilot pipeline konfigurert ved hjelp av bildeanalyse programvaren for en automatisert analyse av de immunofluorescence bildene. Arbeidsflyten er beskrevet i figur 5. I dette tilfellet er det viktig å tilegne seg høy kvalitet immunofluorescence bilder i form av kontrast og fluorescens intensitet. Avhengig av kapasiteten til klynge beregning av maskinvaren, kan bildeanalyse rørledningen brukes på hele det flettede bildet av cytospin eller på et representativt område i cytospin.

Her, basert på mikroskopet, en semi-automatisert skanning av cytospin (X/Y; Z fokus er ikke inkludert) området genererte 150-200 flettede bilder. Disse bildene kan flettes sammen og analyseres direkte ved hjelp av bildeanalyse rørledningen. Denne fremgangsmåten er imidlertid tids-og beregnings klyngeressurs krevende, en viktig begrensning for rutinemessig bruk i laboratorier. Derfor, basert på tidligere erfaringer innen cellulær hematologi, ble det besluttet å analysere representative områder av hver prøve etter verifisering under et mikroskop at fordelingen av celler var homogen på hele området av cytospin. Deretter ble 25% av det totale arealet av cytospin (rundt 40 fliser) skannet med florescence mikroskop for å generere 40 x 4 uavhengige bilder. Den sammenslåtte filen ble delt av kanaler, og bildefiler ble automatisk generert med mikroskop programvaren (se avsnitt 7; Figur 5 A). disse filene ble importert til en bildeanalyse rørledning for analyse i henhold til parametrene som er beskrevet (se avsnitt 8; Figur 5 A).

I figur 5B, vi manuelt identifisert et representativt bilde som viser fire CTC [CD45 (-), PanCK (+), og PD-L1 (+)] blant 77 immunceller [CD45 (+), PanCK (-), og PD-L1 (-)]. Figur 5 B illustrerer hvordan bildeanalyse programvaren identifisert og nummerert antall celler basert på DAPI farging. Den illustrerer også hvordan bildeanalyse programvaren telles sekundære objekter. Til slutt ble fluorescens intensitet for hvert fluorescerende kanaler rapportert for alle objekter som rapporteres i bildene.

Bakgrunnen ble beregnet og representert av de negative cellene som finnes i eksemplet. For eksempel, de ikke-aktiverte immunceller har lav fluorescens intensitet og aktivert måling av bakgrunnen av PanCK og PD-L1 farging. Det fluorescerende signalet ble ansett som positivt hvis fluorescens intensitet oversteg den i bakgrunnen med to ganger (basert på analyse av fire uavhengige pasientprøver). Når det gjelder CD45 farging, som uttrykket nivå av CD45 er svært variabel i de hvite blodlegemer Sub-populasjoner, terskelen til positivitet ble satt så lavt som mulig. Det var basert på analyse av bilder av 10 friske hele blod beiset med CD45 antistoff. Pilot analysen (n = 4) viste samsvars data mellom manuell opplisting og opplisting for bildeanalyse programvare (tabell 2). Hver celle på cytospin er identifisert av bildeanalyse programvare og lar biologer å spore cellen og manuelt bekrefte resultatene, hvis nødvendig.

Figure 1
Figur 1 : Oversikt over arbeidsflyten for rensing av spiral mikrovæskebasert enhet instrumentet. (A) tre viktige trinn er inkludert i renseprosessen (se protokoll), som illustrerer lokalisering av inn-og utganger av instrumentet. (B) representative bilder av A549 i celle serien før og etter rensing av instrumentet. Virkningen av tilstedeværelsen av en smittsom agent på levedyktighet og morfologi av innsamlede celler vises. I nærvær av bakterier, celle morfologi og levedyktighet ble endret. Scale bar = 20 μm. (C) 3D cellekultur beriket pasientprøver av lunge, prostata og brystkreft. Det røde korset tilsvarer atypiske celler. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Oversikt over arbeidsflyten av immunofluorescence analyse fra hele blodprøve til analyse av fluorescens bilder. De viktigste trinnene er vist som følger: blod samling for hele blod, CTC samling med spiral mikrovæskebasert enhet, immunofluorescence analysen, og bildeanalyse programvare. Valget av biomarkør ble drevet av bedre identifisering av de ulike populasjoner av celler Observer på cytospin Slide (CD45 for immunceller, PanCK og PD-L1 for lungekreftceller). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Utvinningsgrad på tre uavhengige farge protokoller. (A) sammenligning av utvinningsgraden av mCTCs fra flytende farging, direkte farging av celle avsatt til polylysine-belagte lysbilder, og celle farging etter cytospin på polylysine-belagt lysbilder. (B) representative bilder av pasientprøvene behandlet med væske IF-protokoll og direkte immunostaining protokoll med cytospinstep. Celler ble farget med CD45 monoklonale antistoff (klone HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonale antistoff (klone AE1/AE3) Alexa fluor 488; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Skala bar = 20 μm. (C) representative bilder av DAPI farging av celle berikelse med og uten cytospin trinn. Den morfologi og størrelse av kjernene ble vist ved hjelp av DAPI farging. Røde Kors fremhever celler med unormalt i kjernen i høyre bilde. I bildet på venstre side er bildet uklart, ettersom cellene ikke er på samme nivå (x-, y-og z-akser). Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Identifikasjon av celle profiler. (A) representative bilder av pasienter med ulike CTC-profiler. De fluorescens kanalene presenteres separat. De flettede bildene vises til venstre. De er farget med CD45 monoklonale antistoff (klone HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonale antistoff (klone AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 monoklonale antistoff (klone 29E2A3) fykoerytrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); piler peker til atypiske celler. (B) representative bilder av immunostaining av to pasientprøver med atypiske hvite blodceller profiler. Celler ble farget med CD45 monoklonale antistoff (klone HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonale antistoff (klone AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 monoklonale antistoff (klone 29E2A3) fykoerytrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Bildet fremhever tilstedeværelsen av immunceller farget med CD45 (+), PanCK (+), og PD-L1 (+). (C) bildet fremhever tilstedeværelsen av umerkede celler (CD45 (-), PanCK (-), og PD-L1 (-). Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Oversikt over analyse av fluorescerende bilder. (A) de viktigste trinnene er beskrevet: mikroskopi skanning, kanalen delt i henhold til fluorescens, og import av filer til bildeanalyse programvare. (B) beskrivelse av de tre ulike trinnene for arbeidsflyten i bildeanalyse programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: manuell opplisting av pasient celle berikelse. Opplisting av celler basert på DAPI farging. Opplisting av andre objekter basert på FITC, PE og CY5 farging.

Table 2
Tabell 2: Bildeanalyse programvare opplisting av pasientens celle berikelse . Opplisting av celler basert på DAPI farging. Opplisting av andre objekter basert på FITC, PE og CY5 farging. Sammenligning av manuelle telle-og bildeanalyse programvare opplisting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

To store punkter ble reist i denne studien, den første med hensyn til utførelsen av arbeidsflyten for overføring til kliniske applikasjoner, og den andre om nedgangen i subjektivitet for analyse av fluorescens bilder innhentet.

En effektiv og optimalisert arbeidsflyt for CTC-opplisting ble opprinnelig bestemt ved hjelp av passelig IF-analyse etter celle berikelse via en CTC-etikett uten mikrovæskebasert system (spiral mikrovæskebasert enhet). Ved hjelp av denne arbeidsflyten, bekreftet en pilotstudie at alle prøvene fra metastatisk NSCLC pasienter inneholdt atypiske celler, som alle var CD45 (-). De kan alternativt være merket med PanCK og/eller PD-L1-biomarkører; de kan imidlertid også være helt negative for alle testede biomarkører [CD45 (-), PanCK (-) og PD-L1 (-) som observert i S19 prøven (tabell 2)]. Dette understreker sterkt behovet for ytterligere biomarkører for bestemmelse av fenotype CTC-undergrupper. Følgelig har det blitt foreslått å tilføye epitel-mesenchymal biomarkører som EpCAM, vimentin, og N-Cadherin; markører for kreft stamceller inkludert CD44 og CD133; og spesifikke tumor markører inkludert TTF1 for lunge adenokarsinom.

I forsøks studien var rekkevidden av atypisk celle [40; > 400] fra 3,5 mL hele blod. For 80% av pasientprøvene var den atypiske celle tellingen over 50. Faktisk, i cytologisk19,20,21 prøver fra Endo bronkial ultra Sonic guide trans bronkial nål aspirasjon eller CT-guidede trans-bryst punktering, PD-L1 analyse er egnet i de fleste av prøvene, men en på ≥ 100 tumorceller er vanligvis innlagt for å produsere en statistisk og klinisk tolkning av verdien. Men i det spesielle tilfelle av blod CTC, bør det bemerkes at spørsmålet om romlig tumor heterogenitet er forbigått i motsetning til små på stedet tumor prøver.

Det andre punktet var å unngå virkningen av behandlingsprogrammet på analyse av immunofluorescence bilder. Bildeanalyse programvare av fluorescerende bilder ble dermed satt opp til å standardisere celle opplisting og gi statistiske data for disse prøvene. Denne automatiserte prosessen understreket behovet for kraftige beregnings klynger for analysen av alle celler som finnes i samme utvalg. I tillegg er kvaliteten på IF farging må være i samme plan (for å unngå bruk av konfokalmikroskopi systemer), og tettheten av celler på cytospin må kalibreres for å aktivere bildeanalyse programvare for å gjenkjenne alle celler separat på lysbildet. Endelig ble resultatene ikke validert om kliniske utfall i en kohort av pasienter, men dette punktet bør tas opp i en annen dedikert studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jean-Philippe aurel og Kathryn Weiqi Li er ansatte i Biolidics selskap som produserer instrumenter som brukes i denne artikkelen. De andre forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra AstraZeneca (London, United-Kingdom), Biolidics (Singapore) og Ligue contre Le Cancer (Saone et Loire, Frankrike). Forfatterne takker AstraZeneca og Biolidics selskaper for deres økonomiske støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Ozyme BLE 422801 Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L BD Biosciences 340345 Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL Biolidics CBB-F016012 Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% Sigma A8412 Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 BioLegend BLE304020 Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software Broad Institute Image Analysis Software
Centrifuge device Hettich 4706 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL Corning 430-829 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL Biolidics CBB-F001004-25 Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System Biolidics CBB-F011002 Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L Beckman Coulter 8448222 All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S Biolidics CBB-FR001002 Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4 ThermoFisher A78300003 Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL Biolidics CBB-F016009 Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels ThermoFisher A78710003 Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent Miltenyi Biotec 130-059-901 Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270-106 Storage conditions: +4 °C
Fluoromount Sigma F4680 Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg Bristol-Myers-Squibb 90129TB29 Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap Biolidics CBB-F013005 Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide Dutscher 50126 Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 ThermoFisher 53-9003-80 Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16% ThermoFisher 11490570 Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin BioLegend BLE329706 Storage conditions: +4 °C
Petri Dish Dutscher 632180 Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) Ozyme BE17-512F Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L 1st Base Laboratory BUF-2040-1X1L Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10% Gibco 24040-032 Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides ThermoFisher J2800AMNZ Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL Falcon 352098 Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL G Biosciences 786-649 Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL G Biosciences 786-650 Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB) Biolidics CBB-F016003 Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge ThermoFisher A78300003 Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator Grace bio-Labs 664270 Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL 1st Base Laboratory CUS-4100-100ml Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 Zeiss Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag SPS Laboratoires 98ULT01240 Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile BD Biosciences 300296 Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile ClearLine 51732 Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software Zeiss Microscope associated software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

Tags

Kreftforskning lungekreft sirkulerende tumorceller sirkulerende gratis DNA immunofluorescence analysen CTC spiral mikrovæskebasert enhet PD-L1
Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia, J., Barthelemy, D., Geiguer, … More

Garcia, J., Barthelemy, D., Geiguer, F., Ballandier, J., Li, K. W., Aurel, J. P., Le Breton, F., Rodriguez-Lafrasse, C., Manship, B., Couraud, S., Payen, L. Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (150), e59873, doi:10.3791/59873 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter