Caenorhabditis elegans中 2-阿拉希多诺诺基甘油定量的分解标准合成
Summary
这项工作描述了一个强大和直接的方法，以检测和量化内分泌大麻素2-阿拉基诺诺甘醇（2-AG）在C.elegans。我们通过同位素稀释和液相色谱-电喷雾电化-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）制备并用于2-AG定量的分析化标准。
Abstract
本工作提出了一种通过液相色谱-电喷雾电化-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）定性和定量分析2-阿拉基诺诺基甘油（2-AG）的分析标准的方法。内分泌大麻素是调节多种生物的多种生物过程的保存脂质中介物。在C.elegans中，2-AG被发现具有不同的作用，包括调节达瑙形成和胆固醇代谢。本报告描述了一种克服与2-AG量化所需的去化标准的成本和稳定性相关的困难的方法。标准合成程序简单，可在任何实验室进行，无需有机合成专业知识或特殊设备。此外，还描述了Folch从C.elegans文化中提取分离标准的方法的修改。最后，描述了一种使用稳定等位标记模拟1-AG-d5检测2-AG的定量和分析方法，在快速色谱运行中提供了可靠的结果。该程序可用于研究 2-AG 在C. elegan 中的多重作用，同时也适用于不同生物体中代谢物的其他研究。
Introduction
内分泌大麻素调节多种生物过程中的多种生物过程，并保存脂质中介1。首次发现且特征最良好的内分泌大麻素是安丹酰胺（阿拉基诺诺醇酰胺，AEA）和2-阿拉奇诺诺基甘油（2-AG）。内分泌大麻素起许多关键作用，包括那些参与大脑奖励系统以及毒瘾，记忆，情绪和代谢过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成，寿命短，通过运输蛋白再摄入和水解3降解。
使用动物模型，如Caenorhabditis elegans （C. elegans）已成为研究各种生物过程，包括凋亡、 细胞信号、 细胞周期、 细胞极性、 基因调控、 代谢、 老化、和性别决定4，5。此外，C. elegans是研究多不饱和脂肪酸 （PUFAs） 生理作用的极佳模型。AEA已在C.elegans中被识别，并在饮食限制6下减少。这种缺陷通过膳食限制机制延长线虫的寿命，这种机制可以通过补充内分泌大麻素来抑制。最近，人们发现2-AG和AEA在管制C.elegans7的胆固醇贩运方面起着基础性作用。更重要的是，它确定，补充外源性2-AG可以拯救牛逮捕，这是由在尼曼-皮克C1型C.elegans突变体中胆固醇贩运受损引起的。
为了更好地了解2-AG与线虫中胆固醇贩运和其他生物过程的关系（即单胺能信号、异位信号和运动），研究这种内源代谢物及其表现至关重要受某些环境和饮食条件影响8、9、10、11、12、13。因此，必须设计和优化一种检测和量化C.elegan中内源性2-AG的方法，这种方法对于不同领域的科学家来说都很简单，特别是那些研究线虫行为的人。内分泌大麻素。
2008 年，Lethonen 和同事使用 LC-MS 分析方法14成功识别了C. elegan 的2-AG 和 AEA。2011年，他们成功地将这项技术推广到其他内分泌大麻素15。最近的研究已经表明，其他分析方法已经成功地检测和量化了C.elegans中的内分泌大麻素，包括质谱和GC-MS 16、17、18，并且它有另据报道，类似的分析方法可以扩展到其他型号19。
以前报告用于量化生物样品中2-AG的分析方法通常涉及使用商业上获取的脱化标准，并要求购买20、21。用于内分泌大麻素的LC-MS/MS定量的许多分析标准可从不同供应商获得。然而，它们价格昂贵，敏感，并且随着时间的推移变得氧化，因为存在多个双键。这些标准最常见的版本是基于八度脱化的阿拉奇酮酸，适合通过同位素稀释LC-MS/MS14，22定量。此外，这些标准大多被替换为甘油的位置2，使它们在大多数条件下不稳定，因为它们容易发生丙基迁移19，23。
为了克服与这些去水标准的成本和稳定性相关的困难，提出了一种方便而简单的方法来准备基于甘油-d5的分析标准。准备五角星标准的顺序需要三步程序，结果为标准的1-AG-d5，这是稳定的，不进行丙基迁移（在旨在合成2个单酸甘油时的主要问题）。
这里的主要目标是展示一种简单且可重复的方法，用于研究C.elegans中的2-AG，包括分析化标准的综合、线虫样品的制备和提取，以及LC-MS/MS的分析（图1）).这种合成程序在没有精密的有机合成知识或特殊设备的情况下是可以实现的，因此适合不同领域的科学家，他们正在研究在内分泌素影响下对C.elegans的行为。该方法还可以扩展到其他研究模型，使其适用于不同的目标。此处报告的标准已应用于成功开发一种快速可靠的色谱方法，以便以可重现的方式有效检测和定量 2-AG。
Protocol
Representative Results
Discussion
内分泌大麻素是一类脂质，在C.elegans7中涉及对种黄的调节。更具体地说，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成对胆固醇贩运和蠕虫的生殖发育非常重要。据此间透露，2-AG是一种含有内分泌大麻素的甲壳类酸，负责使达尔幼虫在胆固醇代谢受损的蠕虫中恢复其正常周期。
鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运和其他生物过程的重要性，以及…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家科学与技术发展协会（ANPCyT，PICT，2014-3693年）的研究赠款的支持。J.F.d.L.、G.P.和B.H.C.是来自CONICET的研究员。D.D.M.和G.R.L.是CONICET研究事业的成员。我们感谢冈萨洛·兰贝托（INMET）的LC-MS/MS分析和有益的讨论。拉米罗·奥尔特加和玛丽亚·索莱达·卡萨索拉拉来自阿根廷罗萨里奥国立罗萨里奥国立体育学院，国际学院。
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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