Syntes av en Deuterat standard för kvantifiering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans
Summary
Detta arbete beskriver en robust och enkel metod för att upptäcka och kvantifiera endocannabinoida 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterisk standard USA beredd och används för kvantifiering av 2-AG med Isotoputspädning och vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Detta arbete presenterar en metod för att förbereda en analytisk standard för att analysera 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt och kvantitativt genom vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids är bevarade Lipidmediatorer som reglerar flera biologiska processer i en mängd olika organismer. I C. elegans, 2-AG har befunnits ha olika roller, inklusive modulering av varaktighet formation och kolesterol metabolism. I denna rapport beskrivs en metod för att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten för de deuteras standarder som krävs för beräkning av 2 AG. Förfarandet för syntes av standarden är enkel och kan utföras i alla laboratorier, utan behov av organisk syntes expertis eller särskild utrustning. Dessutom beskrivs en ändring av Folchs metod för att extrahera den deuterta standarden från kulturen i C. elegans . Slutligen beskrivs en kvantitativ och analytisk metod för att detektera 2-AG med hjälp av den stabila isotopiskt märkta analoga 1-AG-d5 , som ger pålitliga resultat i en snabb kromatografisk körning. Förfarandet är användbart för att studera de multipla rollerna av 2-AG i C. elegans och samtidigt vara tillämpliga på andra studier av metaboliter i olika organismer.
Introduction
Endocannabinoids reglera flera biologiska processer i en mängd olika organismer och bevaras Lipidmediatorer1. Den första upptäckta och mest välkarakteriserade Endocannabinoids är anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) och 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoids spela många viktiga roller, inklusive de som deltar i hjärnan belöningssystem samt narkotikamissbruk, minne, humör, och metaboliska processer2. AEA och 2-AG är endast syntetiserade när det behövs och har korta livslängder, och de bryts ned genom transport protein återupptaget och hydrolys3.
Användningen av djurmodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blivit viktigt att studera den stora variationen av biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, cell cykel, cellpolaritet, genreglering, metabolism, åldrande, och könsbestämning4,5. Dessutom är C. elegans en utmärkt modell för att studera de fysiologiska rollerna av fleromättade fettsyror (pufas). AEA har identifierats i C. elegans och reduceras enligt diet restriktioner6. Denna brist förlänger livslängden på Nematoden genom en mekanism för dietrestriktioner som kan dämpas av tillskott med endocannabinoid. Nyligen upptäcktes att 2-AG och AEA spelar grundläggande roller i regleringen av kolesterol handel i C. elegans7. Ännu viktigare, det bestämdes att tillskott med exogena 2-AG kan rädda varaktighet gripande, som orsakas av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick typ C1 C. elegans mutanter.
För att få en bättre förståelse av 2-AG: s relation med kolesterol handel och andra biologiska processer i Nematoden (dvs., monoaminerga signalering, nociception och förflyttning), är det viktigt att studera denna endogena metabolit och hur det är påverkas under vissa miljö-och diet förhållanden8,9,10,11,12,13. Därför är det viktigt att utforma och optimera en metod för att upptäcka och kvantifiera endogena 2-AG i C. elegans som är enkel att använda för forskare inom olika områden, särskilt de som studerar nematode beteende i förhållande till denna endocannabinoida.
I 2008 lyckades Lethonen och medarbetarna identifiera 2-AG och AEA i C. elegans med hjälp av LC-MS analytiska metoder14. I 2011, lyckades de att utvidga denna teknik till andra Endocannabinoids15. Nyare arbete har visat andra analytiska metoder som har varit framgångsrika i att upptäcka och kvantifiera Endocannabinoids i C. elegans, inklusive masspektrometri och GC-MS16,17,18, och det har också rapporterats att liknande analysmetoder kan utökas till andra modeller19.
Tidigare rapporterade analysmetoder som används för att kvantifiera 2-AG i biologiska prover innebär vanligtvis användning av deutderade standarder som är kommersiellt förvärvade och kräver tillgänglighet för köpet20,21. Många analytiska standarder för LC-MS/MS kvantifiering av Endocannabinoids är kommersiellt tillgängliga från olika leverantörer. Ändå, de är dyra, är känsliga, och blir oxiderade över tiden, på grund av närvaron av flera dubbelbindningar. De vanligaste versionerna av dessa standarder är baserade på den Octa-deutiska arakidsyran och är lämpliga för kvantifiering genom Isotoputspädning LC-MS/MS14,22. Också, de flesta av dessa standarder ersätts i läge 2 av glycerol, vilket gör dem instabila under de flesta förhållanden eftersom de är benägna att Acyl migration19,23.
För att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten i dessa deutade standarder, en bekväm och enkel metod presenteras för att förbereda en analytisk standard baserad på glycerol-d5. Sekvensen för att förbereda den Penta-deutererade standarden kräver ett tre stegs förfarande som resulterar i standard 1-AG-d5, som är stabil och inte genomgår Acyl migration (den viktigaste frågan när man siktar på att syntetisera 2-monoacylglycerols).
Det huvudsakliga målet här är att visa en enkel och reproducerbar metod för att studera 2-AG i C. elegans, inklusive syntesen av den analytiska deutererstandarden, beredning och extraktion av nematodproverna, och analys av LC-MS/MS (figur 1 ). Detta syntetiska förfarande är uppnåeligt utan sofistikerade organiska syntes kunskap eller speciell utrustning, vilket gör det lämpligt för forskare från olika områden som studerar C. elegans beteende under endocannabinoida inflytande. Metoden är också utbyggbar till andra studiemodeller, vilket gör den användbar för olika mål. Standarden, som utarbetats som rapporterats här, har tillämpats för att framgångsrikt utveckla en snabb och tillförlitlig kromatografisk metod som möjliggör effektiv detektering och kvantifiering av 2-AG på ett reproducerbart sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endocannabinoids är en klass av lipider som har varit inblandade i regleringen av varaktighet formation i C. elegans7. Mer specifikt är syntesen av fleromättade fettsyror (PUFAs) viktigt för kolesterol handel och reproduktiva utvecklingen av maskar. Det avslöjas här att 2-AG, en arakidonsyra syra innehåller endocannabinoid, är ansvarig för att restitutera den varaktighet larv till sin normala cykel i maskar som har nedsatt kolesterol metabolism7.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., och B.H.C. är stipendiater från CONICET. D.d.M. och GRL är medlemmar i forskningskarriären för CONICET. Vi är tacksamma för att Gonzalo Lamberto (INMET) för LC-MS/MS analys och hjälpsam diskussion. Videoupptagning och-redigering har gjorts av Ramiro Ortega och María Soledad Casasola från Dirección de Comunicación de La Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
