Syntese af en deutereret standard for kvantificering af 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

Summary

Dette arbejde beskriver en robust og ligetil metode til at detektere og kvantificere endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deutereret standard os tilberedt og anvendt til kvantificering af 2-AG ved isotop fortynding og væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Dette arbejde præsenterer en metode til at udarbejde en analytisk standard til analyse af 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt ved væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoider er bevaret lipid mediatorer, der regulerer flere biologiske processer i en række organismer. I C. elegans, 2-AG har været fundet at besidde forskellige roller, herunder graduering af Dauer dannelse og kolesterol metabolisme. I denne rapport beskrives en metode til at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med omkostninger og stabilitet i de deutererede standarder, der kræves til kvantificering af 2 AG. Proceduren for syntesen af standarden er enkel og kan udføres i ethvert laboratorium, uden behov for organisk syntese ekspertise eller særligt udstyr. Desuden er en ændring af Folch metode til at udtrække den er standard fra C. elegans kultur er beskrevet. Endelig beskrives en kvantitativ og analytisk metode til påvisning af 2-AG ved hjælp af den stabile isotopisk mærkede analoge 1-AG-d₅ , som giver pålidelige resultater i en hurtig kromatografisk kørsel. Proceduren er nyttig til at studere de mange roller 2-AG i C. elegans , mens også gælder for andre undersøgelser af metabolitter i forskellige organismer.

Introduction

Endocannabinoider regulere flere biologiske processer i en række organismer og er bevaret lipid mediatorer¹. De første opdagede og mest velkarakteriserede endocannabinoider er anandamid (arachidonoylethanolamid, AEA) og 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoider spille mange kritiske roller, herunder dem, der er involveret i hjernen belønning systemer samt stofmisbrug, hukommelse, humør, og metaboliske processer². AEA og 2-AG er kun syntetiseret når det er nødvendigt og har korte levetid, og de nedbrydes gennem transport protein reuptake og hydrolyse³.

Brugen af dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) er blevet vigtigt at studere de mange forskellige biologiske processer, herunder apoptose, celle signalering, celle cyklus, celle polaritet, genregulering, metabolisme, aldring, og kønsbestemmelse^4,5. Derudover er C. elegans en glimrende model til at studere de fysiologiske roller af flerumættede fedtsyrer (pufas). AEA er blevet identificeret i C. elegans og er reduceret under kosten begrænsning⁶. Denne mangel forlænger levetiden af fyrretræsnematoden gennem en kost begrænsning mekanisme, der kan undertrykkes af tilskud med endocannabinoid. For nylig blev det opdaget, at 2-AG og AEA spiller grundlæggende roller i reguleringen af kolesterol handel i C. elegans⁷. Endnu vigtigere, det blev fastslået, at tilskud med udefrakommende 2-AG kan redde Dauer anholdelse, som er forårsaget af den svækkede kolesterol handel i Niemann-pick type C1 C. elegans mutanter.

For at få en bedre forståelse af 2-ag’s forhold til kolesterol handel og andre biologiske processer i fyrretræsnematoden (dvs. monoaminerge signalering, nociception og bevægelse), er det afgørende at studere denne endogene metabolit og hvordan det er påvirket under visse miljømæssige og ernæringsmæssige forhold^{8,9,10,11,12,13}. Derfor er det bydende nødvendigt at designe og optimere en metode til at detektere og kvantificere endogene 2-AG i C. elegans , der er enkel at bruge for forskere i forskellige områder, især dem, der studerer nematode adfærd i forhold til denne endocannabinoide.

I 2008 lykkedes det for Leth onen og kolleger at identificere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjælp af LC-MS analytiske metoder¹⁴. I 2011, de formåede at udvide denne teknik til andre endocannabinoider¹⁵. Nyere arbejde har vist andre analytiske metoder, der har haft succes med at påvise og kvantificere endocannabinoider i C. elegans, herunder massespektrometri og GC-^{MS 16,17,18}, og det har også blevet rapporteret, at lignende analytiske metoder kan udvides til andre modeller¹⁹.

Tidligere rapporterede analysemetoder, der anvendes til kvantificering af 2-AG i biologiske prøver, indebærer normalt brug af deutererede standarder, der er erhvervet kommercielt, og som kræver tilgængelighed for købet^20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantificering af endocannabinoider er kommercielt tilgængelige fra forskellige udbydere. Ikke desto mindre, de er dyre, er følsomme, og bliver oxideret over tid, på grund af tilstedeværelsen af flere dobbelt obligationer. De mest almindeligt forekommende versioner af disse standarder er baseret på den OCTA-deutererede arachidonsyre og egner sig til kvantificering ved isotop fortynding LC-MS/MS^14,22. Også, de fleste af disse standarder er erstattet i position 2 af glycerol, hvilket gør dem ustabile under de fleste betingelser, da de er tilbøjelige til acyl migration^19,23.

For at overvinde vanskelighederne forbundet med omkostningerne og stabiliteten af disse er standarder, en bekvem og enkel metode er præsenteret for at udarbejde en analytisk standard baseret på glycerol-d₅. Sekvensen til at forberede Penta-deuterated standard kræver en tre-trins procedure, der resulterer i standard 1-AG-d₅, som er stabil og ikke undergår acyl migration (det vigtigste spørgsmål, når de sigter mod at syntetisere 2-monoacylglyceroler).

Hovedformålet er her at vise en enkel og reproducerbar metode til at studere 2-AG i C. elegans, herunder syntesen af den analytiske er standard, klargøring og ekstraktion af fyrretræsnematoden prøverne, og analyse af LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske procedure er opnåelig uden den sofistikerede organiske syntese viden eller specialudstyr, hvilket gør det velegnet til forskere fra forskellige områder, der studerer C. elegans opførsel under endocannabinoide indflydelse. Metoden kan også udvides til andre studie modeller, hvilket gør den anvendelig til forskellige mål. Standarden, udarbejdet som rapporteret her, er blevet anvendt til med succes at udvikle en hurtig og pålidelig kromatografi metode, der giver mulighed for effektiv påvisning og kvantificering af 2-AG i en reproducerbar måde.

Protocol

1.1-AG-d5 forberedelse Bemærk: for at opnå 1-AG-d5 som en deutereret intern standard for kvantificerings analyser, Følg protokollen som beskrevet nedenfor. Differentieret beskyttelse For kun at beskytte primære alkoholer skal der først tilsættes 38 mg glycerol-d8 til et 10 ml reaktions slange med en Pasteur-pipette og tilsættes en magnetisk omrører. Der tilsættes 5 mL vandfri dichlormethan (DCM) ved hjælp af en 5 mL Hamilt…

Representative Results

En isotopisk mærket analog blev med held syntetiseret fra kommercielt tilgængelig d8-glycerol og arachidonsyre ved hjælp af en 3-trins syntetisk metode (figur 2, figur 3). Disse trin er ligetil og kræver ikke sofistikeret udstyr, specielt kontrollerede forhold, eller dyre reagenser. Således, denne metode er robust og kan med succes udvides til at syntetisere monoacylglycerider indeholdende forskellige fedtsyrer.</…

Discussion

Endocannabinoider er en klasse af lipider, som har været impliceret i reguleringen af Dauer dannelse i C. elegans⁷. Mere specifikt, syntesen af flerumættede fedtsyrer (PUFAs) er vigtig for kolesterol handel og reproduktiv udvikling af orme. Det er afsløret her, at 2-AG, en arachidonsyre, der indeholder endocannabinoid, er ansvarlig for at restituere Dauer larve til sin normale cyklus i orme, der har nedsat kolesterol metabolisme⁷.

I b…

Materials

4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)