Caenorhabditis elegans में 2-Arachidonoylglycerol के क्वांटाइज के लिए एक ड्यूरेटेड मानक का संश्लेषण
Summary
यह काम का पता लगाने और endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) सी elegansमें की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और सीधा तरीका का वर्णन करता है। एक विश्लेषणात्मक ड्यूरेट मानक हमें तैयार किया और isotopic तहलका और तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 2-AG की मात्रा के लिए इस्तेमाल किया-electrospray ionization-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस /
Abstract
यह काम 2-arachidonoyl ग्लिसरॉल (2-AG) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस) का विश्लेषण करने के लिए एक विश्लेषणात्मक मानक तैयार करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। एंडोकैनाबिनोइड लिपिड मध्यस्थों को संरक्षित कर ते हैं जो विभिन्न जीवों में अनेक जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। सी elegansमें, 2-AG dauer गठन और कोलेस्ट्रॉल चयापचय के मॉडुलन सहित विभिन्न भूमिकाओं के अधिकारी पाया गया है. यह रिपोर्ट 2-AG परिमाणीकरण के लिए आवश्यक ड्यूरेट मानकों की लागत और स्थिरता से जुड़ी कठिनाइयों को दूर करने के लिए एक विधि का वर्णन करती है। मानक के संश्लेषण के लिए प्रक्रिया सरल है और किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है, कार्बनिक संश्लेषण विशेषज्ञता या विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता के बिना. इसके अलावा, C. elegans संस्कृति से deuterated मानक निकालने के लिए Folch विधि का एक संशोधन का वर्णन किया गया है. अंत में, एक मात्रात्मक और विश्लेषणात्मक विधि स्थिर आइसोटोप्लासी लेबल एनालॉग 1-AG-d5 का उपयोग कर 2-AG का पता लगाने के लिए वर्णित है, जो एक तेजी से वर्णलेखीय चलाने में विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है. प्रक्रिया सी elegans में 2-AG की कई भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जबकि भी विभिन्न जीवों में चयापचयों के अन्य अध्ययनों के लिए लागू किया जा रहा है.
Introduction
एंडोकैनाबिनोइड विभिन्न प्रकार के जीवों में अनेक जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं और लिपिड मध्यस्थ1का संरक्षण करते हैं। पहली खोज की और सबसे अच्छी तरह से विशेषता endocannabinoids anandamide (arachidonoylethanolamide, एईए) और 2-arachidonoyl ग्लिसरॉल (2-एजी) हैं। Endocannabinoids मस्तिष्क इनाम प्रणाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नशीली दवाओं की लत, स्मृति, मूड, और चयापचय प्रक्रियाओं2में शामिल उन सहित कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. एईए और 2-एजी केवल संश्लेषित कर रहे हैं जब जरूरत है और कम जीवन काल है, और वे परिवहन प्रोटीन reuptake और hydrolysis3के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं.
Caenorhabditis elegans (सी elegans) जैसे पशु मॉडल का उपयोग apoptosis सहित जैविक प्रक्रियाओं की बड़ी विविधता का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है, सेल संकेतन, सेल चक्र, सेल polarity, जीन विनियमन, चयापचय, उम्र बढ़ने, और लिंग निर्धारण4,5. इसके अतिरिक्त, सी elegans polyunsaturated फैटी एसिड (PUFAs) की शारीरिक भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है. एईए की पहचान सी एलिगेंस में की गई है और इसे आहार प्रतिबंध6के तहत कम किया गया है . यह कमी एक आहार प्रतिबंध तंत्र है कि endocannabinoid के साथ पूरकता द्वारा दबा या जा सकता है के माध्यम से सूत्रकृमि की उम्र फैली हुई है. हाल ही में, यह पता चला है कि 2-AG और AEA सी elegans7में कोलेस्ट्रॉल की तस्करी के विनियमन में मौलिक भूमिका निभाते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह निर्धारित किया गया था कि exogenous के साथ पूरकता 2-AG dauer गिरफ्तारी बचाव कर सकते हैं, जो Niemann-पिक प्रकार C1 सी elegans उत्परिवर्ती में बिगड़ा कोलेस्ट्रॉल की तस्करी के कारण होता है.
सूत्रकृमि में कोलेस्ट्रॉल की तस्करी और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के साथ 2-AG के संबंधों की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए (यानी, मोनोएमिनर्जिक संकेतन, नोसिसेप्शन और चलन), यह इस अंतर्जात मेटाबोलाइट का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह कैसे है कुछ पर्यावरण और आहार संबंधी परिस्थितियों में प्रभावित8,9,10,11,12,13. इसलिए, यह डिजाइन और एक विधि का पता लगाने और सी elegans में अंतर्जात 2-AG मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि विभिन्न क्षेत्रों के वैज्ञानिकों के लिए उपयोग करने के लिए सरल है, विशेष रूप से जो लोग इस के संबंध में सूत्रकृमि के व्यवहार का अध्ययन एन्डोकैनाबिनॉइड.
2008 में, Lethonen और सहकर्मियों LC-एमएस विश्लेषणात्मक तरीकों14का उपयोग कर सी elegans में 2-AG और एईए की पहचान करने में सफल रहा। 2011 में, वे अन्य endocannabinoids15करने के लिए इस तकनीक का विस्तार करने में कामयाब रहे. हाल ही में काम अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों है कि पता लगाने और सी elegansमें endocannabinoids की मात्रा में सफल रहा है दिखाया गया है , बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री और जीसी-एमएस16सहित ,17,18, और यह है यह भी सूचित किया गया है कि इसी प्रकार की विश्लेषणात्मक विधियों का विस्तार अन्य मॉडलों में किया जा सकताहै.
पहले जैविक नमूनों में 2-एजी की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयुक्त विश्लेषणात्मक विधियों की रिपोर्ट की गई थी जिसमें आमतौर पर ड्यूरेट मानकों का उपयोग शामिल होता है जो वाणिज्यिक रूप से प्राप्त किए जाते हैं और खरीद के लिए उपलब्धता की आवश्यकता होती है20,21. एंडोक्नाबिनोइड के एलसी-एमएस/एमएस परिमाणीकरण के लिए कई विश्लेषणात्मक मानक विभिन्न प्रदाताओं से वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं। फिर भी, वे महंगे हैं, संवेदनशील हैं, और समय के साथ ऑक्सीकरण हो जाते हैं, कई डबल बांड की उपस्थिति के कारण. इन मानकों का सबसे आम संस्करण ऑक्टा-ड्यूरेटेड अराचिडोनिक एसिड पर आधारित है और आइसोटोप कमजोर पड़ने एलसी-एमएस14,22द्वारा परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, इन मानकों में से अधिकांश ग्लिसरॉल की स्थिति 2 में प्रतिस्थापित कर रहे हैं, उन्हें ज्यादातर परिस्थितियों में अस्थिर कर रही है क्योंकि वे acyl प्रवास के लिए प्रवण हैं19,23.
लागत और इन deuterated मानकों की स्थिरता के साथ जुड़े कठिनाइयों को दूर करने के लिए, एक सुविधाजनक और सरल विधि ग्लिसरोल-डी5के आधार पर एक विश्लेषणात्मक मानक तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। पेंटा-ड्यूरेट मानक तैयार करने के लिए अनुक्रम एक तीन-चरण प्रक्रिया है कि मानक में परिणाम की आवश्यकता है 1-AG-d5, जो स्थिर है और acyl प्रवास से गुजरना नहीं है (मुख्य मुद्दा जब 2-monoacylglycerols संश्लेषित करने के लिए लक्ष्य).
यहाँ मुख्य उद्देश्य सी elegansमें 2-AG अध्ययन करने के लिए एक सरल और reproduible विधि दिखाने के लिए है, विश्लेषणात्मक deuterated मानक के संश्लेषण सहित, तैयारी और सूत्रकृमि के नमूनों की निकासी, और LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण (चित्र 1) ). इस सिंथेटिक प्रक्रिया परिष्कृत कार्बनिक संश्लेषण ज्ञान या विशेष उपकरणों के बिना प्राप्त है, यह विभिन्न क्षेत्रों जो endocannabinoid प्रभाव के तहत सी elegans व्यवहार का अध्ययन कर रहे हैं से वैज्ञानिकों के लिए उपयुक्त बना रही है. विधि भी अन्य अध्ययन मॉडल के लिए विस्तार योग्य है, यह विभिन्न लक्ष्यों के लिए उपयोगी बना रही है. मानक, यहाँ की सूचना के रूप में तैयार, सफलतापूर्वक एक तेजी से और विश्वसनीय क्रोमैटोग्राफी विधि है कि प्रभावी पता लगाने और एक reproduible तरीके से 2-एजी के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है विकसित करने के लिए लागू किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एंडोक्नाबिनोइड लिपिड का एक वर्ग है जिसे सी एलिगन्स7में डाउर गठन के विनियमन में फंसाया गया है . अधिक विशेष रूप से, पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड (पीयूए) का संश्लेषण कोलेस्ट्रॉल की तस्करी और कीड़…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Agencia Nacional de Promoci]n Cient]fica y Tecnol]gica (ANPCyT, PICT 2014-3693) से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. J.F.d.L., G.P., और B.H.C. CONICET से साथी हैं. D.d.M. और G.R.L. CONICET के अनुसंधान कैरियर के सदस्य हैं. हम LC-MS/MS विश्लेषण और उपयोगी चर्चा के लिए गोंजालो Lamberto (INMET) के लिए आभारी हैं. वीडियो शूटिंग और संपादन Ramiro Ortega और मारिआ Soledad Casasola द्वारा किया गया है Direccien de Comunicaci-n de la Ciencia, Facultad de Ciencia पोलेटिका y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario में Rosario, अर्जेंटीना.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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