Syntese av en Deuterert standard for kvantifisering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

Summary

Dette arbeidet beskriver en robust og grei metode for å oppdage og kvantifisere endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterert standard oss forberedt og brukes for kvantifisering av 2-AG ved isotopanrikning fortynning og flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Dette arbeidet presenterer en metode for å utarbeide en analytisk standard for å analysere 2-arachidonoyl glyserol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt av flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids er bevart lipid meglere som regulerer flere biologiske prosesser i en rekke organismer. I C. elegans, 2-AG har blitt funnet å ha ulike roller, inkludert modulering av dauer dannelse og kolesterol metabolisme. Denne rapporten beskriver en metode for å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i deuterert standarder som kreves for 2-AG kvantifisering. Prosedyren for syntese av standarden er enkel og kan utføres i ethvert laboratorium, uten behov for Organisk syntese ekspertise eller spesialutstyr. Dessuten, en modifisering av Folch ‘ metoden å ekstra det deuterert målestokk fra C. elegans kulturen er beskrevet. Til slutt, en kvantitativ og analytisk metoden å merker 2-AG benytter det stabile isotopically benevnt analog 1-AG-d₅ er beskrevet, hvilke skaffer pålitelig resultater inne en rask-kromatografiske løpe. Fremgangsmåten er nyttig for å studere flere roller av 2-AG i C. elegans samtidig som gjelder for andre studier av metabolitter i ulike organismer.

Introduction

Endocannabinoids regulere flere biologiske prosesser i en rekke organismer og er bevart lipid meglere¹. Den første oppdaget og mest godt preget endocannabinoids er anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) og 2-arachidonoyl glyserol (2-AG). Endocannabinoids spiller mange kritiske roller, inkludert de som er involvert i hjerne belønningssystemer, samt narkotikaavhengighet, minne, humør og metabolske prosesser². AEA og 2-AG er bare syntetisert ved behov og har kortlevetid spenn, og de er degradert gjennom transport protein reopptak og hydrolyse³.

Bruken av dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blitt viktig å studere det store utvalget av biologiske prosesser inkludert apoptose, celle signalering, celle syklus, celle polaritet, gen regulering, metabolisme, aldring, og sex besluttsomhet^4,5. I tillegg er C. elegans en utmerket modell for å studere de fysiologiske rollene til flerumettede fettsyrer (fuf). AEA har blitt identifisert i C. elegans og er redusert under kosttilskudd restriksjon⁶. Denne mangelen forlenger levetiden til nematode gjennom et kosttilskudd Begrensnings mekanisme som kan undertrykkes av tilskudd med endocannabinoid. Nylig ble det oppdaget at 2-AG og AEA spille fundamentale roller i regulering av kolesterol handel i C. elegans⁷. Enda viktigere var det fastslått at tilskudd med eksogene 2-AG kan redde dauer arrest, som er forårsaket av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanter.

For å få en bedre forståelse av 2-AG forhold til kolesterol handel og andre biologiske prosesser i nematode (dvs. monoaminergic signalering, Nociception og bevegelse), er det avgjørende å studere denne endogene metabolitten og hvordan det er påvirket under visse miljø-og diett forhold^{8,9,10,11,12,13}. Derfor er det viktig å designe og optimalisere en metode for å oppdage og kvantifisere endogene 2-AG i C. elegans som er enkel å bruke for forskere i ulike felt, spesielt de som studerer nematode atferd i forhold til dette endocannabinoid.

I 2008 lyktes Lethonen og kollegaer i å identifisere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjelp av LC-MS analytiske metoder¹⁴. I 2011 klarte de å utvide denne teknikken til andre endocannabinoids¹⁵. Nyere arbeid har vist andre analytiske metoder som har lykkes i å oppdage og kvantifisere endocannabinoids i C. elegans, inkludert Mass massespektrometri og GC-MS^16,17,18, og det har også blitt rapportert at lignende analytiske metoder kan utvides til andre modeller¹⁹.

Tidligere rapportert analytiske metoder som brukes for kvantifisere 2-AG i biologiske prøver vanligvis innebære bruk av deuterert standarder som er kommersielt ervervet og krever tilgjengelighet for kjøpet^20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantifisering av endocannabinoids er kommersielt tilgjengelig fra ulike tilbydere. Likevel, de er dyre, er følsomme, og blir oksidert over tid, på grunn av tilstedeværelsen av flere doble obligasjoner. De vanligste versjonene av disse standardene er basert på oktav-deuterert arachidonic syre og er egnet for kvantifisering av isotop fortynning LC-MS/MS^14,22. Også de fleste av disse standardene er erstattet i posisjon 2 av glyserol, noe som gjør dem ustabile under de fleste forhold siden de er utsatt for acyl migrasjon^19,23.

For å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i disse deuterert standarder, en praktisk og enkel metode er presentert for å utarbeide en analytisk standard basert på glyserol-d₅. Sekvensen for å forberede Penta-deuterert standard krever en tre-trinns prosedyre som resulterer i standard 1-AG-d₅, som er stabil og ikke gjennomgår acyl migrasjon (Hovedproblemet når satsing å syntetisere 2-monoacylglycerols).

Hovedmålet her er å vise en enkel og reproduserbar metode for å studere 2-AG i C. elegans, inkludert syntese av analytiske deuterert standard, utarbeidelse og ekstraksjon av nematode prøvene, og analyse av LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske prosedyren er oppnåelig uten sofistikert Organisk syntese kunnskap eller spesialutstyr, noe som gjør det egnet for forskere fra ulike felt som studerer C. elegans oppførsel under endocannabinoid innflytelse. Metoden kan også utvides til andre studie modeller, noe som gjør det nyttig for ulike mål. Standarden, utarbeidet som rapportert her, har blitt brukt for å lykkes utvikle en rask og pålitelig kromatografiske metode som gjør det mulig for effektiv påvisning og kvantifisering av 2-AG i en reproduserbar måte.

Protocol

1.1-AG-d5 forberedelse Merk: for å få 1-AG-d5 som en deuterert intern standard for kvantifisering analyser, følg protokollen som beskrevet nedenfor. Differensial beskyttelse For å bare beskytte primære alkoholer, først legge 38 mg glyserol-d8 til en 10 ml reaksjons rør ved hjelp av en Pasteur pipette og legge til en magnetisk rører. Tilsett 5 mL vannfri diklormetan (DCM) ved hjelp av et 5 mL Hamilton sprøyte, og fyll røret…

Representative Results

En isotopically merket analog ble med hell syntetisert fra kommersielt tilgjengelige d8-glyserol og arachidonic syre ved hjelp av en 3-trinns syntetisk metode (figur 2, Figur 3). Disse trinnene er enkle og krever ikke avansert utstyr, spesielt kontrollerte forhold eller kostbare reagenser. Således, denne metoden er robust og kanskje være med hell utbygget å syntetisere monoacylglycerides inneholder annerledes fatty …

Discussion

Endocannabinoids er en klasse av lipider som har vært innblandet i regulering av dauer dannelse i C. elegans⁷. Mer spesifikt, er syntesen av flerumettede fettsyrer (Fuf) viktig for kolesterol handel og den reproduktive utviklingen av ormer. Det er avslørt her at 2-AG, en arachidonic syre som inneholder endocannabinoid, er ansvarlig for restituting dauer Larven til normal syklus i ormer som har nedsatt kolesterol metabolisme⁷.

Gitt den …

Materials

4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)