Levende celle Fluorescens mikroskopi til at undersøge subcellulære protein lokalisering og celle morfologi ændringer i bakterier
Summary
Denne artikel indeholder en trinvis vejledning til undersøgelse af protein subcellulær lokaliserings dynamik og til overvågning af morfologiske ændringer ved hjælp af Fluorescens mikroskopi i høj opløsning i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus.
Abstract
Undersøgelser af faktorer, der påvirker celledeling og celle form i bakterier, udføres almindeligvis sammen med højopløsnings Fluorescens mikroskopi, da observationer foretaget på et populationsniveau måske ikke i virkeligheden afspejler, hvad der sker på et enkelt celleniveau. Live-Cell timelapse mikroskopi giver undersøgere mulighed for at overvåge ændringer i celledeling eller celle morfologi, som giver værdifuld indsigt om subcellulære lokalisering af proteiner og timing af genekspression, som det sker, til potentielt støtte i besvarelsen af vigtige biologiske spørgsmål. Her beskriver vi vores protokol til overvågning af fænotypiske ændringer i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus ved hjælp af et højopløsnings-devolution-mikroskop. Formålet med denne rapport er at tilvejebringe en enkel og klar protokol, som kan vedtages af andre efterforskere, der er interesseret i at gennemføre eksperimenter med Fluorescens mikroskopi for at studere forskellige biologiske processer i bakterier og andre organismer.
Introduction
Området for bakteriel cellebiologi er blevet betydeligt forbedret af de seneste fremskridt i mikroskopi teknikker1,2. Blandt andre instrumenter, mikroskoper, der er i stand til at gennemføre timelapse Fluorescens mikroskopi eksperimenter forbliver et værdifuldt værktøj. Efterforskere kan overvåge forskellige fysiologiske hændelser i realtid ved hjælp af fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende protein (GFP)-baseret transkriptional og translationel reporter fusioner, fluorescerende D-aminosyrer (FDAA)3, eller bruge andre pletter til mærkning af cellevæg, MEMBRAN og DNA. Det er derfor ikke overraskende, at Fluorescens mikroskopi fortsat er populær blandt mikrobielle celle biologer. Ud over blot at vise de endelige fænotyper, giver oplysninger om, hvordan de observerede fænotyper opstår ved hjælp af timelapse mikroskopi kunne tilføje betydelig værdi til resultaterne og potentielt give fingerpeg om, hvad cellulære processer målrettes af potentielle Drug kandidater4.
Protokollerne til at gennemføre højopløsningsbilleder ved hjælp af et fuldt motoriseret, inverteret, bredt felt fluorescens mikroskop (Se tabellen over materialer) er angivet i denne artikel. Disse protokoller kan tilpasses behovene i andre fluorescens mikroskoper, der er i stand til at gennemføre timelapse mikroskopi. Selv om den software, der diskuteres her, svarer til den specifikke producent-leverede software som angivet i tabellen over materialer, software, der almindeligvis leveres af andre mikroskop fabrikanter eller den frit tilgængelige ImageJ5, har tilsvarende værktøjer til at analysere mikroskopi data. For betingelser, hvor timelapse ikke er befordrende, kunne tidsforløb eksperimenter udføres som beskrevet i denne artikel. De protokoller, der er beskrevet her, giver en detaljeret vejledning til undersøgelse af fænotypiske ændringer i to forskellige bakteriearter: B. subtilis og S. aureus. Se tabel 1 for anvendte stammer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi er forblevet en grundpille i undersøgelser vedrørende mikrobielle organismer. På grund af deres micron-skala Cellestørrelse, har enkelt celleniveau undersøgelser traditionelt påberåbt sig elektronmikroskopi (EM). Selv om EM er blevet en ganske kraftfuld teknik i de seneste år, det har sine egne iboende begrænsninger ud over begrænset bruger adgang16. Forbedringer i Fluorescens mikroskopi teknikker og udvikling af forskellige fluorescerende sonder, såsom FDAA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker vores Lab medlemmer for deres kommentarer til denne artikel. Dette arbejde blev finansieret af et opstarts stipendium fra University of South Florida (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
