Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken
Summary
Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.
Abstract
Onderzoeken van factoren die van invloed zijn op celdeling en celvorm in bacteriën worden vaak uitgevoerd in combinatie met hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie, aangezien waarnemingen op een populatieniveau niet echt kunnen weerspiegelen wat er op één celniveau gebeurt. Live-cel timelapse microscopie stelt onderzoekers in staat om de veranderingen in celdeling of celmorfologie te monitoren die waardevolle inzichten bieden met betrekking tot subcellulaire lokalisatie van eiwitten en timing van genexpressie, zoals het gebeurt, om potentieel te helpen bij het beantwoorden van belangrijke biologische vragen. Hier beschrijven we ons protocol voor het monitoren van fenotypische veranderingen in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus met behulp van een high-resolution deconvolutie Microscoop. Het doel van dit verslag is om een eenvoudig en duidelijk protocol te bieden dat kan worden aangenomen door andere onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie-experimenten om verschillende biologische processen in bacteriën en andere organismen te bestuderen.
Introduction
Het gebied van bacteriële celbiologie is aanzienlijk verbeterd door recente ontwikkelingen in microscopie technieken1,2. Naast andere instrumenten blijven microscopen die in staat zijn om timelapse-fluorescentiemicroscopie-experimenten uit te voeren een waardevol hulpmiddel. Onderzoekers kunnen verschillende fysiologische gebeurtenissen in real-time monitoren met behulp van fluorescerende eiwitten zoals, groene fluorescerende proteïne (GFP) gebaseerde transcriptionele en translationele reporter Fusions, fluorescerende D-aminozuren (FDAA)3, of andere vlekken gebruiken voor het labelen van de celwand, het membraan en het DNA. Het is daarom geen verrassing dat fluorescentiemicroscopie populair blijft onder microbiële celbiologen. Naast het simpelweg tonen van de end fenotypes, het verstrekken van informatie over hoe de waargenomen fenotypes ontstaan met behulp van timelapse microscopie kan aanzienlijke waarde toevoegen aan de bevindingen en potentieel bieden aanwijzingen over wat cellulaire processen worden gericht door potentiële drug kandidaten4.
De protocollen voor het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie met behulp van een volledig gemotoriseerde, omgekeerde, breed-veld fluorescentiemicroscoop (Zie de tabel met materialen) zijn in dit artikel beschikbaar. Deze protocollen kunnen worden aangepast aan de behoeften van andere fluorescentie microscopen die in staat zijn om timelapse-microscopie uit te voeren. Hoewel de hier besproken software overeenkomt met de specifieke door de fabrikant geleverde software zoals aangegeven in de tabel met materialen, software die gewoonlijk wordt geleverd door andere Microscoop fabrikanten of de vrij beschikbare imagej5, hebben gelijkwaardige tools voor het analyseren van microscopie gegevens. Voor de omstandigheden waarin timelapse niet bevorderlijk is, kunnen tijd-cursus experimenten worden uitgevoerd zoals beschreven in dit artikel. De hier beschreven protocollen bieden een gedetailleerde handleiding voor het bestuderen van de fenotypische veranderingen in twee verschillende bacteriesoorten: B. subtilis en S. aureus. Zie tabel 1 voor gebruikte stammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopie bleef een steun Piler in studies met betrekking tot microbiële organismen. Gezien hun micron schaal celgrootte, eencellige studies hebben traditioneel vertrouwd op elektronenmicroscopie (EM). Hoewel EM in de afgelopen jaren behoorlijk een krachtige techniek is geworden, heeft het naast beperkte gebruikers toegang16ook zijn eigen intrinsieke beperkingen. Verbeteringen in fluorescentiemicroscopie technieken en de ontwikkeling van verschillende fluorescentie sondes, zoals FDAA<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken onze lableden voor hun opmerkingen over dit artikel. Dit werk werd gefinancierd door een start-up subsidie van de Universiteit van Zuid-Florida (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
