Live-Cellfluorescens mikroskopi för att undersöka subcellulära protein lokalisering och cellmorfologi förändringar i bakterier
Summary
Den här artikeln innehåller en steg-för-steg-guide för att undersöka protein subcellulär lokalisering dynamik och övervaka morfologiska förändringar med högupplöst fluorescens mikroskopi i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus.
Abstract
Undersökningar av faktorer som påverkar celldelning och cell form hos bakterier utförs vanligen tillsammans med högupplöst fluorescens-mikroskopi, eftersom observationer som gjorts på populationsnivå inte riktigt återspeglar vad som sker på en enda cellnivå. Live-cell Timelapse mikroskopi kan utredarna att övervaka förändringar i celldelning eller cellmorfologi som ger värdefulla insikter om subcellulär lokalisering av proteiner och timing av genuttryck, som det händer, till potentiellt stöd i att besvara viktiga biologiska frågor. Här, vi beskriver vårt protokoll för att övervaka fenotypiska förändringar i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus med hjälp av en högupplöst deconvolution Mikroskop. Syftet med denna rapport är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan antas av andra utredare som är intresserade av att bedriva fluorescensmikroskopi experiment för att studera olika biologiska processer i bakterier och andra organismer.
Introduction
Området för bakteriell cellbiologi har förbättrats avsevärt genom de senaste framstegen inom mikroskopi tekniker1,2. Bland andra instrument, Mikroskop som kan utföra Timelapse fluorescens mikroskopi experiment förblir ett värdefullt verktyg. Utredare kan övervaka olika fysiologiska händelser i realtid med hjälp av fluorescerande proteiner som, grön fluorescerande protein (GFP)-baserade transkriptionella och translationella reporter fusioner, fluorescerande D-aminosyror (FDAA)3, eller använda andra fläckar för märkning av cellväggen, membran och DNA. Det är därför ingen överraskning att fluorescensmikroskopi fortfarande är populärt bland mikrobiella cellbiologer. Förutom att bara visa slutet fenotyper, ge information om hur de observerade fenotyperna uppstår med hjälp av Timelapse mikroskopi kan tillföra betydande värde till resultaten och potentiellt ge ledtrådar om vilka cellulära processer som riktas mot potentiella läkemedelskandidater4.
Protokollen för att genomföra högupplösta bilder med hjälp av ett helt motoriserat, inverterat, brett fält fluorescens-Mikroskop (se material tabellen) finns i denna artikel. Dessa protokoll kan anpassas för att passa behoven hos andra fluorescensmikroskop som kan utföra Timelapse-mikroskopi. Även om programvaran diskuteras här motsvarar den specifika tillverkaren medföljande programvara som anges i tabellen av material, programvara som vanligen tillhandahålls av andra Mikroskop tillverkare eller fritt tillgängliga imagej5, har likvärdiga verktyg för att analysera mikroskopi data. För villkor där Timelapse inte bidrar, kan tidsförlopp experiment utföras enligt beskrivningen i denna artikel. De protokoll som beskrivs här ger en detaljerad guide för att studera fenotypiska förändringar i två olika bakteriearter: B. subtilis och S. aureus. Se tabell 1 för stammar som används.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi har varit en stöttepelare i studier som rör mikrobiella organismer. Med tanke på deras micron skala Cellstorlek, encellig nivå studier har traditionellt förlitat sig på elektronmikroskopi (EM). Även om EM har blivit en ganska kraftfull teknik under de senaste åren har det sina egna inneboende begränsningar utöver begränsad användaråtkomst16. Förbättringar i fluorescensmikroskopi tekniker och utveckling av olika fluorescerande sonder, såsom FDAA3, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra labb medlemmar för deras kommentarer om den här artikeln. Detta arbete finansierades genom ett startbidrag från University of South Florida (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
