En murine cellelinje baseret model af kronisk CDK9 hæmning at studere udbredte ikke-genetiske Transkriptional forlængelse defekter (TEabsolut) i kræft
Summary
Protokollen beskriver en in vitro-murine karcinom model af ikke-genetisk defekt transkriptionsforlængelse. Her bruges kronisk hæmning af CDK9 til at undertrykke produktiv forlængelse af RNA pol II langs pro-inflammatoriske respons gener til at efterligne og studere den klinisk overserverede TEabsolut fænomen, til stede i omkring 20% af alle kræfttyper.
Abstract
Vi har tidligere rapporteret, at en delmængde af kræft er defineret af globale transkriptionelle dereguleringer med udbredte mangler i mRNA transkriptionen forlængelse (TE)-vi kalder sådanne kræftformer som TEabsolut. Især, TEabsolut kræft er karakteriseret ved falsk transkriptionen og defekt mRNA behandling i et stort sæt af gener, såsom INTERFERON/Jak/stat og TNF/NF-κb veje, fører til deres undertrykkelse. TEabsolut under type af tumorer i renal celle karcinom og metastaserende melanompatienter signifikant korrelerer med dårlig respons og udfald i immunterapi. I betragtning af vigtigheden af at undersøge TEabsolut kræft-da det porerer en betydelig vejspærring mod immunterapi-målet med denne protokol er at etablere en in vitro tehelt sikkert musemodel til at studere disse udbredte, ikke-genetiske transkriptionelle abnormiteter i kræft og få ny indsigt, nye anvendelser for eksisterende lægemidler, eller finde nye strategier mod sådanne kræftformer. Vi detaljer brugen af kronisk flavopiridol medieret CDK9 hæmning til ABRO fosforylering af Serin 2 rester på C-Terminal REPEAT domæne (CTD) af RNA polymerase II (RNA pol II), undertrykke frigivelsen af RNA pol II i produktive transkriptionen forlængelse. I betragtning af at TEabsolut kræft ikke er klassificeret under nogen specifik somatisk mutation, en farmakologisk model er fordelagtig, og bedst efterligner de udbredte transkriptional og epigenetiske defekter observeret i dem. Brugen af en optimeret subletale dosis af flavopiridol er den eneste effektive strategi i at skabe en generaliserbar model af ikke-genetisk udbredt forstyrrelse i transkriptionsforlængelse og mRNA-behandlings defekter, tæt efterligne den klinisk observerede te helt sikkert egenskaber. Derfor kan denne model af TEhelt sikkert udnyttes til dissekere, celle-autonome faktorer, der gør dem i stand til at modstå immunmedierede celle angreb.
Introduction
Et centralt sats begrænsende trin i ekspression af næsten alle aktive gener er overgangen af RNA-polymerase II (RNA pol II) fra promotor-proximal pauser til produktiv forlængelse1,2. I betragtning af, at epigenetiske dysregulering af transkriptional forlængelse hjælper i progression af flere humane maligniteter defineret som TEafgjort, hvilket fører til suboptimal signalering i de pro-inflammatoriske respons veje svarende til en dårlig respons og resultat til immunterapi3, er det overordnede mål med denne protokol at etablere en nyttig in vitro-model til at studere disse udbredte ikke-genetiske transkriptionelle abnormiteter i kræft. I lyset heraf er brugen af kronisk farmakologisk hæmning af CDK9 en effektiv strategi for at skabe en generaliserbar model for ikke-genetisk udbredte forstyrrelser i transkriptionsforlængelsen og mRNA-behandlings defekter. Rationalet bag brugen af kronisk CDK9 hæmning er, at det ophæver fosforylering af Serin 2-rester på C-terminalens gentagelses domæne (CTD) af RNA pol II og dermed undertrykker frigivelsen af RNA pol II til produktiv transskription forlængelse. Også, TEafgjort kræft, beskrevet tidligere af vores gruppe3, er ikke klassificeret under nogen specifik somatisk mutation. Derfor er en ikke-genetisk (farmakologisk) model er fordelagtig og bedst efterligner de udbredte transkriptionelle og epigenetiske defekter observeret i dem. Metoden heri beskriver generering og karakterisering af kronisk flavopiridol behandling model af murine cancerceller. Denne metode forstyrrer påviseligt transskription forlængelse langs gener karakteriseret ved længere genomisk længder, med klar promotorer og inducerbare udtryk såsom TNF/NF-κb og interferon/stat signalering, dybt kontrolleret på niveau med transkriptionsforlængelse3,4,5. Samlet set denne optimerede murine cellelinje model af transkriptional forlængelse fejl-den eneste model til vores viden til at studere den nyligt beskrevne TEabsolut tumorer-drev resistens over for anti-tumor immun angreb, hvilket gør et nyttigt system til at udnytte og undersøge sårbarheden af ikke-genetiske defekter i kernen transskription maskiner i kræft i forhold til immunmedierede celle angreb.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA pol II forlængelse kontrol er dukket op som en afgørende løftestang til regulering stimulus-lydhør genekspression til gavn for maligne celler5,7,8. Overvindelse af promotor-proksimal pauser til forlængelse og efterfølgende mRNA-produktion kræver kinaseaktiviteten af P-tefb9,10,11. Vores model udnytter flavopiridol (25 nM), en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af NIC (CA193549) og CCHMC Research innovation pilot Awards til Kakajan Komurov, og Department of Defense (BC150484) Award til Navneet Singh. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller Department of Defense. De finansieringskilder havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
