Un modelo basado en la línea celular murina de la inhibición crónica de CDK9 para estudiar defectos de alargamiento transcripcional no genéticos generalizados (TEdefinitivamente)en cánceres
Summary
El protocolo detalla un modelo de carcinoma murino in vitro de alargamiento de transcripción defectuosa no genética. Aquí, la inhibición crónica de CDK9 se utiliza para reprimir el alargamiento productivo del ARN Pol II a lo largo de genes de respuesta proinflamatoria para imitar y estudiar el fenómeno te definitivamente clínicamente sobrecumplido, presente enaproximadamente el 20% de todos los tipos de cáncer.
Abstract
Hemos informado previamente que un subconjunto de cánceres se define por la desregulación transcripcional global con deficiencias generalizadas en el alargamiento de transcripción de ARNm (TE), llamamos cánceres como TEdefinitivamente. En particular, los cánceres TEdefinitivamente se caracterizan por la transcripción espuria y el procesamiento defectuoso de ARNm en un gran conjunto de genes, como las vías de interferón/JAK/STAT y TNF/NF-B, lo que conduce a su supresión. El TEdefinitivamente subtipo de tumores en pacientes con carcinoma de células renales y melanoma metastásico se correlaciona significativamente con una respuesta y un resultado deficientes eninmunoterapia. Dada la importancia de investigar los cánceresDE, ya que augura un obstáculo significativo contra la inmunoterapia, el objetivo de este protocolo es establecer un modelo in vitro de ratón TEpara estudiar estos modelos generalizados y no genéticos anormalidades transcripcionales en los cánceres y obtener nuevos conocimientos, nuevos usos de medicamentos existentes, o encontrar nuevas estrategias contra tales cánceres. Detallamos el uso de la inhibición crónica mediada por flavopiridol CDK9 para abrogar la fosforilación de residuos de serina 2 en el dominio de repetición C-terminal (CTD) de ARN polimerasa II (RNA Pol II), suprimiendo la liberación de ARN Pol II en transcripción productiva Alargamiento. Dado que los cánceres TEdefinitivamente no están clasificados bajo ninguna mutación somática específica, un modelo farmacológico es ventajoso, y mejor imita los defectos transcripcionales y epigenéticos generalizados observados en ellos. El uso de una dosis subletal optimizada de flavopiridol es la única estrategia eficaz para crear un modelo generalizable de alteración generalizada no genética en defectos de elongación de transcripción y procesamiento de ARNm, imitando estrechamente el TE clínicamente observado características definitivamente. Por lo tanto, este modelo de TEdefinitivamente se puede aprovechar para diseccionar, factores autónomos celulares que les permiten resistir el ataque celular mediado inmune.
Introduction
Un paso clave que limita la tasa en la expresión de casi todos los genes activos es la transición del ARN polimerasa II (RNA Pol II) de la pausa promotor-proximal a la elongación productiva1,2. Dado que la desregulación epigenética de la elongación transcripcional ayuda en la progresión de múltiples neoplasias malignas humanas definidas como TEdefinitivamente,lo que conduce a una señalización subóptima en las vías de respuesta proinflamatoria que equivalen a una respuesta deficiente y el resultado de la inmunoterapia3, el objetivo general de este protocolo es establecer un modelo in vitro útil para estudiar estas anomalías transcripcionales no genéticas generalizadas en los cánceres. En este sentido, el uso de la inhibición farmacológica crónica de CDK9 es una estrategia eficaz para crear un modelo generalizable de interrupción generalizada no genética en el alargamiento de transcripción y defectos de procesamiento de ARNm. La razón de ser detrás del uso de la inhibición crónica de CDK9 es que abroga la fosforilación de los residuos de serina 2 en el dominio de repetición C-terminal (CTD) del ARN Pol II, reprimiendo así la liberación de ARN Pol II en el alargamiento de transcripción productiva. Además, los cánceres TEdefinitivamente, descritos previamente por nuestro grupo3,no están clasificados bajo ninguna mutación somática específica. Por lo tanto, un modelo no genético (farmacológico) es ventajoso y mejor imita los defectos transcripcionales y epigenéticos generalizados observados en ellos. El método aquí en aquí detalla la generación y caracterización del modelo de tratamiento crónico de flavopiridol de las células cancerosas murinas. Este método interrumpe de manera demostrable el alargamiento de la transcripción a lo largo de genes caracterizados por longitudes genómicas más largas, con promotores preparados y expresiones inducibles como TNF/NF–B e señalización de interferón/STAT, profundamente controlados a nivel de alargamiento de transcripción3,4,5. En general, este modelo optimizado de la línea celular murina de defectos de alargamiento transcripcional, el único modelo de nuestro conocimiento para estudiar los tumores TEdefinitivamente recién descritos, impulsa la resistencia al ataque inmune antitumoral, haciendo un sistema útil para explotar y explotar y examinar las vulnerabilidades de los defectos no genéticos en la maquinaria de transcripción de núcleos en cánceres frente al ataque celular mediado por el sistema inmunitario.
Protocol
Representative Results
Discussion
El control de alargamiento del ARN Pol II ha surgido como una palanca decisiva para regular la expresión génica sensible al estímulo en beneficio de las células malignas5,7,8. La superación de la pausa promotor-proximal al alargamiento y posterior producción de ARNm requiere la actividad quinasa de P-TEFb9,10,11. Nuestro modelo ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los premios NCI (CA193549) y CCHMC Research Innovation Pilot a Kakajan Komurov, y el premio del Departamento de Defensa (BC150484) a Navneet Singh. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o del Departamento de Defensa. Los fórhechos no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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