कैंसर में क्रोनिक CDK9 निषेध के एक Murine सेल लाइन आधारित मॉडल व्यापक गैर-आनुवंशिक ट्रांसक्रिटिकल दीर्घीकरण दोष (टीईनिश्चित रूप से) का अध्ययन करने के लिए
Summary
प्रोटोकॉल में गैर-आनुवंशिक दोषपूर्ण प्रतिलेखन दीर्घीकरण के इन विट्रो मर्निएन कार्सिनोमा मॉडल का विवरण दिया गया है। यहाँ, CDK9 की पुरानी निषेध समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया जीन के साथ आरएनए पोल द्वितीय के उत्पादक दीर्घीकरण को दबाने के लिए प्रयोग किया जाता है नकल और नैदानिक overserved TEनिश्चित रूप से घटना का अध्ययन, सभी कैंसर प्रकार के बारे में 20% में मौजूद.
Abstract
हम पहले की सूचना दी है कि कैंसर का एक सबसेट वैश्विक प्रतिलेखन deregulations द्वारा परिभाषित किया गया है MRNA प्रतिलेखन दीर्घीकरण में व्यापक कमी के साथ (टीई) -हम इस तरह के कैंसर के रूप में TEनिश्चित रूप सेकहते हैं. विशेष रूप से, तेनिश्चित रूप से कैंसर नकली प्रतिलेखन और जीन के एक बड़े सेट में दोषपूर्ण MRNA प्रसंस्करण की विशेषता है, जैसे interferon/JAK/STAT और TNF/NF-जेडबी रास्ते, उनके दमन के लिए अग्रणी. टीनिश्चित रूप से गुर्दे सेल कार्सिनोमा और मेटास्टैटिक मेलेनोमा रोगियों में ट्यूमर के उपप्रकार काफी प्रतिरक्षा चिकित्सा में गरीब प्रतिक्रिया और परिणाम के साथ सहसंबंधित. TE निश्चित रूपसे कैंसर की जांच के महत्व को देखते हुए-के रूप में यह इम्यूनोथेरेपी के खिलाफ एक महत्वपूर्ण बाधा portends-इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो TEनिश्चित रूप से माउस मॉडल स्थापित करने के लिए इन व्यापक, गैर-आनुवंशिक अध्ययन है कैंसर में प्रतिलेखन असामान्यताएं और नई अंतर्दृष्टि हासिल, मौजूदा दवाओं के लिए उपन्यास का उपयोग करता है, या इस तरह के कैंसर के खिलाफ नई रणनीति मिल. हम आरएनए पॉलिमरेज II (आरएनए पोल II) के सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सेरीन 2 अवशेषों के फॉस्फोरिएशन को समाप्त करने के लिए पुरानी फ्लेवोपिरिडॉल मध्यस्थता CDK9 अवरोध के उपयोग का विस्तार से, उत्पादक प्रतिलेखन में आरएनए पोल II की रिहाई को दबा रहे हैं बढ़ाव. यह देखते हुए कि TEनिश्चित रूप से कैंसर किसी भी विशिष्ट दैहिक उत्परिवर्तन के तहत वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं, एक औषधीय मॉडल लाभप्रद है, और सबसे अच्छा व्यापक प्रतिलेखनीय और epigenetic दोष उन में मनाया नकल. flavopiridol की एक अनुकूलित sublethal खुराक का उपयोग ट्रांसक्रिप्शन दीर्घीकरण और MRNA प्रसंस्करण दोष में गैर आनुवंशिक व्यापक व्यवधान का एक सामान्य मॉडल बनाने में केवल प्रभावशाली रणनीति है, बारीकी से नैदानिक मनाया TE नकल निश्चित रूप से विशेषताओं. इसलिए, TE के इस मॉडलनिश्चित रूप से विच्छेदन करने के लिए leveraged किया जा सकता है, सेल-स्वायत्त कारकों उन्हें प्रतिरक्षा मध्यस्थता सेल हमले का विरोध करने में सक्षम करने के लिए.
Introduction
लगभग सभी सक्रिय जीनों की अभिव्यक्ति में एक प्रमुख दर-सीमा-निर्धारण कदम आरएनए पॉलिमरेज II (आरएनए पोल II) को प्रवर्तक-प्रोक्सिमल ठहराव से उत्पादक दीर्घीकरण1,2में संक्रमण है। यह देखते हुए कि ट्रांसपेरेंसी लम्बन के epigenetic dysgation TEनिश्चित रूप सेके रूप में परिभाषित कई मानव द्रोह की प्रगति में सहायता करता है , एक गरीब प्रतिक्रिया के लिए राशि समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया रास्ते में suboptimal संकेतन के लिए अग्रणी और इम्यूनोथेरेपीकेलिए परिणाम 3 , इस प्रोटोकॉल के व्यापक लक्ष्य कैंसर में इन व्यापक गैर आनुवंशिक प्रतिलेखन असामान्यताओं का अध्ययन करने के लिए इन व्यापक गैर-आनुवंशिक ट्रांसक्रिप्शनल असामान्यताओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयोगी स्थापित करने के लिए है। इस प्रकाश में, CDK9 की पुरानी औषधीय निषेध का उपयोग प्रतिलेखन दीर्घीकरण और MRNA प्रसंस्करण दोष में गैर आनुवंशिक व्यापक व्यवधान का एक सामान्य योग्य मॉडल बनाने के लिए एक प्रभावशाली रणनीति है. पुरानी CDK9 निषेध का उपयोग करने के पीछे तर्क यह है कि यह आरएनए पोल द्वितीय के सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सेरीन 2 अवशेषों के फॉस्फोरिलेशन को समाप्त करता है, इस प्रकार उत्पादक प्रतिलेखन दीर्घीकरण में आरएनए पोल द्वितीय की रिहाई को दबा रहा है। इसके अलावा, TEनिश्चित रूप से कैंसर, हमारे समूह3द्वारा पहले वर्णित, किसी भी विशिष्ट दैहिक उत्परिवर्तन के तहत वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं. इसलिए, एक गैर-आनुवंशिक (फार्माकोलॉजिकल) मॉडल लाभप्रद है और सबसे अच्छा उनमें मनाया व्यापक प्रतिलेखनीय और एपिजेनेटिक दोषों की नकल करता है। विधि इसमें murine कैंसर कोशिकाओं की पुरानी flavopiridol उपचार मॉडल की पीढ़ी और लक्षण का विवरण. इस विधि में स्पष्ट रूप से जीन ों के साथ प्रतिलेखन दीर्घीकरण को बाधित किया जाता है, जिसमें लंबे समय तक जीनोमिक लंबाई की विशेषता होती है, जिसमें तैयार प्रमोटर और प्रेरक अभिव्यक्ति जैसे TNF/NF-$B और इंटरफेरॉन/स्टेट संकेतन, गहराई से नियंत्रित स्तर पर नियंत्रित होता है प्रतिलेखन दीर्घीकरण3,4,5. कुल मिलाकर, ट्रांसक्रिप्शनल दीर्घीकरण दोष के इस अनुकूलित murine सेल लाइन मॉडल-हमारे ज्ञान के लिए केवल मॉडल नव वर्णित TEनिश्चित रूप से ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा हमले के लिए प्रतिरोध ड्राइव, शोषण करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली प्रतिपादन और प्रतिरक्षा-मध्यस्थ कोशिका हमले की तुलना में कैंसर में कोर प्रतिलेखन मशीनरी में गैर-आनुवंशिक दोषों की कमजोरियों की जांच करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए पोल द्वितीय दीर्घीकरण नियंत्रण घातक कोशिकाओं5,7,8 के लाभ के लिए उत्तेजना-प्रतिक्रियाशील जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक निर्णायक लीवर के रूप में उभराह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनसीआई (CA193549) और सीसीएचएमसी रिसर्च इनोवेशन पायलट पुरस्कार काकाजन कोमुराव और रक्षा विभाग (बीसी 150484) ने नवनीत सिंह को प्रदान किया। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या रक्षा विभाग के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
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