En murin Cellinsbaserad modell av kronisk CDK9 hämning för att studera utbredd icke-genetiska transkriptionella förlängning defekter (TEdefinitivt) i cancer
Summary
Protokollet Detaljer en in vitro murina carcinoma modell av icke-genetiska defekt transkription förlängning. Här, kronisk hämning av CDK9 används för att förtrycka produktiv förlängning av RNA-pol II längs pro-inflammatoriska svar gener för att efterlikna och studera kliniskt överserveras TEdefinitivt fenomen, närvarande i cirka 20% av alla cancertyper.
Abstract
Vi har tidigare rapporterat att en delmängd av cancer definieras av globala transkriptionella avregleringar med utbredda brister i mRNA transkription förlängning (te)-vi kallar sådana cancer som tedefinitivt. Särskilt TEdefinitivt cancer kännetecknas av falska transkription och felaktig mRNA bearbetning i en stor uppsättning av gener, såsom INTERFERON/Jak/stat och TNF/NF-κb vägar, vilket leder till deras förtryck. TEdefinitivt subtyp av tumörer i njurcellscancer och metastaserande melanom patienter korrelerar signifikant med dålig respons och utfall i immunterapi. Med tanke på vikten av att undersöka TEdefinitivt cancer-eftersom det förebådar en betydande vägspärrar mot immunterapi-målet med detta protokoll är att upprätta en in vitro-tedefinitivt musmodell för att studera dessa utbredda, icke-genetiska transkriptionella avvikelser i cancer och få nya insikter, nya användningsområden för befintliga läkemedel, eller hitta nya strategier mot sådana cancerformer. Vi detalj användningen av kronisk flavopiridol medierad CDK9 hämning att upphäva fosforylering av serin 2 rester på C-terminalen upprepa domän (CTD) av RNA-polymeras II (RNA-pol II), undertrycka frisättning av RNA-pol II till produktiv transkription Förlängning. Med tanke på att TEdefinitivt cancer inte klassificeras under någon specifik somatisk mutation, en farmakologisk modell är fördelaktigt, och bäst härmar de utbredda transkriptionella och epigenetiska defekter som observerats i dem. Användningen av en optimerad subletala dos av flavopiridol är den enda effektiva strategin för att skapa en generaliserbar modell av icke-genetiska utbredda störningar i transkription förlängning och mRNA bearbetningsdefekter, nära imitera den kliniskt observerade te definitivt egenskaper. Därför, denna modell av TEdefinitivt kan utnyttjas för att dissekera, cell-autonoma faktorer som gör det möjligt för dem att motstå immunmedierad cell attack.
Introduction
Ett nyckelhastighetsbegränsande steg i uttrycket av nästan alla aktiva gener är övergången av RNA-polymeras II (RNA-pol II) från Promotorn-proximal paus till produktiv förlängning1,2. Med tanke på att epigenetisk dysreglering av transkriptionell förlängning bistår i utvecklingen av flera mänskliga maligniteter definieras som TEdefinitivt, vilket leder till suboptimala signalering i pro-inflammatoriska responsvägar som uppgår till en dålig respons och utfall till immunterapi3, det övergripande målet med detta protokoll är att etablera en användbar in vitro-modell för att studera dessa utbredda icke-genetiska transkriptionella avvikelser i cancer. Mot denna bakgrund är användningen av kronisk farmakologisk hämning av CDK9 en effektiv strategi för att skapa en generaliserbar modell av icke-genetiska utbredda störningar i transkriptionsförlängning och mRNA-bearbetningsdefekter. Logiken bakom att använda kronisk CDK9 hämning är att det upphäver fosforylering av serin 2 rester på C-terminalen upprepa domän (CTD) av RNA-pol II, därmed undertrycka frisättning av RNA-pol II till produktiv transkription förlängning. Också, TEdefinitivt cancer, beskrivs tidigare av vår grupp3, klassificeras inte under någon specifik somatisk mutation. Därför är en icke-genetisk (farmakologisk) modell fördelaktig och bäst härmar de utbredda transkriptionella och epigenetiska defekter som observerats i dem. Metoden häri beskriver generering och karakterisering av kronisk flavopiridol behandlingsmodell av murina cancerceller. Denna metod stör bevisligen transkriptionsförlängning längs gener som kännetecknas av längre genomiska längder, med redo initiativtagare och inducerbara uttryck såsom TNF/NF-κb och interferon/stat signalering, djupt kontrollerad på nivån för transkriptionsförlängning3,4,5. Sammantaget denna optimerade murina cell linje modell av transkriptionella förlängning defekter-den enda modellen till vår kännedom att studera den nyligen beskrivna tedefinitivt tumörer-driver resistens mot anti-tumör immun angrepp, vilket gör ett användbart system för att utnyttja och undersöka sårbarheter i icke-genetiska defekter i kärntranskription maskiner i cancer vis-à-vis immunmedierad cell attack.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-pol II-förlängningen har framträtt som en avgörande hävstång för att reglera stimulans-lyhörd genuttryck till förmån för maligna celler5,7,8. Övervinna promotor-proximala pausa till förlängning och efterföljande mRNA produktion kräver Kinas aktiviteten av P-tefb9,10,11. Vår modell använder flavopiridol (25 nM), en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av NCI (CA193549) och CCHMC Research innovation pilot Awards till Kakajan Komurov, och Department of Defense (BC150484) Award till Navneet Singh. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Cancer Institute eller Department of Defense. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
