Ex Vivo Oculomotor Slice Культура от эмбриональных GFP-Expressing мышей для Time-Lapse Imaging Oculomotor Нерв Рост
Summary
Экзвио ломтик асссе позволяет oculomotor нервный рост, чтобы быть изображены в режиме реального времени. Фрагменты генерируются путем встраивания E10.5 IslMN:GFP эмбрионов в агарозе, нарезки на вибратом, и растет в стадии верхней инкубатора. Роль аксонов пути руководства оценивается путем добавления ингибиторов в культуре средств массовой информации.
Abstract
Точные движения глаз имеют решающее значение для зрения, но развитие глазной двигательной системы, особенно молекулярных путей контроля аксон руководства, не были полностью выяснены. Отчасти это связано с техническими ограничениями традиционных аксонов. Для выявления дополнительных аксонов наведения сигналы, влияющие на окуломоторный нерв, ex vivo ломтик асссе для изображения окуломоторного нерва в режиме реального времени, как он растет к глазу был разработан. E10.5 IslMN-GFP эмбрионы используются для создания ex vivo ломтики путем встраивания их в агарозу, нарезка на вибратом, а затем выращивать их в микроскоп этапе инкубатор с замедленной фотомикроскопии для 24-72 ч. Контроль ные части recapitulate in vivo синхронизации нарастания аксонов от ядра до орбиты. Небольшие молекулярные ингибиторы или рекомбинантные белки могут быть добавлены в культурные носители для оценки роли различных путей наведения аксона. Этот метод имеет преимущества поддержания большей части локальной микросреды, через которую пересекают аксоны, а не аксотомизации растущих аксонов, и оценки аксонов в нескольких точках по их траектории. Он также может определить влияние на конкретные подмножества аксонов. Например, ингибирование CXCR4 вызывает аксоны еще в середине мозга расти дорсально, а не венттально, но аксоны, которые уже вышли венттально не влияет.
Introduction
Глазная моторная система обеспечивает элегантную систему для исследования механизмов наведения аксона. Это относительно несложный, состоящий из трех черепных нервов, иннервирующих шесть экстраокулярных мышц (EOMs), которые двигают глаз, и леватор palpebrae superioris (LPS), который поднимает век. Окуломоторный нерв иннервирует LPS и четыре EOMs – нижние косые и медиальный, нижний, и превосходные мышцы прямой кишки. Два других нерва, trochlear и abducens, каждый только innervate одной мышцы, выше косой и боковой мышцы прямой кишки, соответственно. Движения глаз обеспечивают легкое считывание, показывая, если иннервация была уместной, отсутствует, или аномальные. Кроме того, Есть человеческие расстройства движения глаз, которые являются результатом дефицита в развитии нейронов или аксон руководства, коллективно называют врожденные расстройства дезиннервации черепа (CCDDs)1.
Несмотря на эти преимущества, глазная моторная системаредко используется в исследованиях аксона 2,3,4,5,6, 8, 9 До 9 , 10, из-за технических недостатков. In vitro axon руководство анализы имеют много недостатков11. Анализы сокультуры, в которых нейрональные экспланты культивируются вместе с высадками целевой ткани12 или транс-инфицированных клеток13,зависят как от симметрии экспланта, так и от точного позиционирования между эксплантировой и целевой тканью. Полоса анализы14,15, в котором два сигнала изложены в чередующихся полос и аксонов оцениваются для преференциального роста на одной полосе, только указывают, что один субстрат предпочтительнее другого, не то, что либо является привлекательным или отталкивающим, или физиологически актуальным. Microfluidics камеры могут образовывать точные химические градиенты, но при условии выращивания аксонов сдвига стресс16,17,18, которые могут повлиять на их рост. Кроме того, в каждом из этих подходов, сбор explants или диссоциированных клеток требует, чтобы перерастания аксонов быть акотомизированы и, таким образом, эти анализы на самом деле изучить аксон регенерации, а не первоначальный аксон рост. Наконец, эти подходы in vitro удаляют микросреду, которая влияет на аксоны и их реакцию на сигналы по разным точкам их курса, и традиционно тестируют только один сигнал в изоляции. Усугубляя эти недостатки, небольшой размер каждого ядра в глазной двигательной системе делает вскрытие технически сложным для эксплантированных или диссоциированных культур. Кроме того, первичные культуры глазных моторных нейронов, как правило, неоднородны, имеют значительную гибель клеток, и зависят от плотности, требуя объединения клеток из нескольких эмбрионов (Ryosuki Fujiki, личное общение). In vivo методы, однако, в том числе нокаут мыши модели, не уместны для использования для скрининга, учитывая время и расходы, необходимые.
Методы, разработанные для культуры целых эмбрионов19 позволяют маркировки мигрирующих клеток20 или блокады конкретных молекул21, но целые культуры эмбриона требуют инкубации в роликовых бутылках, что исключает в режиме реального времени изображения помечены Структуры. Хирургические методы, которые позволяют манипуляции эмбриона, а затем последующее дальнейшее развитие либо в матке или в брюшной полости матери (поддержание плацентарной связи)22 также возможны, но они также не позволяют промежуток времени Изображений.
Чтобы преодолеть препятствия in vitro анализы и позволяют быстрый скрининг сигнальных путей, ex vivo эмбриональных срез культуры техника была разработана23, адаптированы из ранее опубликованного протокола для периферических нервных нарастания24. Используя этот протокол, развивающийся окуломоторный нерв может быть изображен с течением времени в присутствии многих окружающих структур по его траектории, включая цели EOM. Добавляя небольшие молекулярные ингибиторы, факторы роста или сигналы руководства к культурным носителям, мы можем оценить возмущения руководства в нескольких точках вдоль траектории аксона, что позволяет более быстро оценивать потенциальные факторы роста и руководства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол культуры культуры ex vivo обеспечивает значительные преимущества по сравнению с традиционными аксоновыми инструкциями23. Размер каждого черепного опрокидного ядра не является ограничивающим фактором, и никакого сложного вскрытия не требуется. Эндогенная микр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование, предоставляемое Национальным институтом глаз (5K08EY027850), Национальным институтом детского здоровья и развития (U54HD090255), Гарвардской клинической научной программой развития (5K12EY016335), Фондом тамплиеров «Карьера Стартера» Гранта, и Детский больничный офтальмология Фонда «Факультет Открытие премии». ECE является Говард Хьюз медицинский институт следователя.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
