Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

आरएनए के पैरों के निशान की पहचान: TANDEM में आरएनए इम्यूनोएरिफ़िएसिस के माध्यम से प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अनुक्रमण द्वारा पीछा किया (RIPIT-सेक)

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59913
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Summary

यहाँ, हम अंतर्जात आरएनए बाध्यकारी साइटों या आरएनए के "फुटप्रिंट" को समृद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत: प्रोटीन (आरएनपी) स्तनधारी कोशिकाओं से परिसरों. इस दृष्टिकोण में आरएनपी उपइकाइयों के दो इम्यूनोवेरिफ़िएंस शामिल हैं और इसलिए इसे अग्रानुक्रम (आरआईपीटी) में आरएनए इम्यूनोप्रीसेंस कहा जाता है।

Abstract

आरएनए प्रतिरक्षा अग्रानुक्रम में (RIPIT) एक आरएनए:प्रोटीन (आरएनपी) परिसर के भीतर प्रोटीन की एक जोड़ी के आरएनए पैरों के निशान को समृद्ध करने के लिए एक विधि है। RIPIT दो शुद्धि कदम कार्यरत हैं. सबसे पहले, एक टैग आरएनपी सबयूनिट के इम्यूनोप्रीफिकेशन हल्के RNase पाचन और बाद में गैर-denaturing आत्मीयता elution द्वारा पीछा किया जाता है। एक और आरएनपी उपइकाई का दूसरा इम्यूनोप्रीफिशेशन एक परिभाषित परिसर के संवर्धन के लिए अनुमति देता है। आरएनए और प्रोटीन के एक denaturing elution के बाद, आरएनए पैरों के निशान उच्च थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों में परिवर्तित कर रहे हैं। आरबीपी बाइंडिंग साइटों को समृद्ध करने के लिए इम्यूनोप्रिसेप्शन (सीआईआईपी) दृष्टिकोण के बाद अधिक लोकप्रिय पराबैंगनी (यूवी) क्रॉसलिंकिंग के विपरीत, RIPIT यूवी-क्रॉसलिंकिंग स्वतंत्र है। इसलिए RIPIT आरएनए interactome में मौजूद कई प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और उससे परे आरएनए विनियमन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन सीधे आरएनए या यूवी-क्रॉसलिंक खराब आरएनए से संपर्क नहीं करते। RIPIT में दो शुद्धि कदम बाध्यकारी साइटों की पहचान करने का एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करते हैं, जहां ब्याज का एक प्रोटीन एक और cofactor के साथ साझेदारी में कार्य करता है. डबल शुद्धि रणनीति भी पृष्ठभूमि सीमित द्वारा संकेत बढ़ाने के लिए कार्य करता है. यहाँ, हम RIPIT प्रदर्शन करने के लिए और अलग आरएनए पैरों के निशान से उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए एक कदम वार प्रक्रिया प्रदान करते हैं। हम भी RIPIT के फायदे और अनुप्रयोगों की रूपरेखा और अपनी सीमाओं में से कुछ पर चर्चा.

Introduction

कोशिकाओं के भीतर, आरएनए प्रोटीन के साथ जटिल में मौजूद है आरएनए बनाने के लिए: प्रोटीन परिसरों (RNPs). RNPs आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के आसपास इकट्ठे होते हैं (RBPs, उन है कि सीधे आरएनए बाँध) लेकिन यह भी गैर-RBPs शामिल (उन है कि आरबीपी बाँध लेकिन आरएनए नहीं), और अक्सर प्रकृति में गतिशील हैं. नियामक कार्यों को निष्पादित करने के लिए आरएनपी के भीतर आरएनपी और उनके सहकारक सामूहिक रूप से कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, निरर्थक मध्यस्थता MRNA क्षय (NMD) मार्ग में, UPF प्रोटीन (UPF1, UPF2, और UPF3b) समय से पहले समाप्त राइबोसोम को पहचानते हैं। UPF प्रोटीन के प्रत्येक आरएनए करने के लिए बाध्य कर सकते हैं, लेकिन यह केवल जब वे एक साथ इकट्ठा है कि एक सक्रिय एनएमडी परिसर के रूप में शुरू होता है. इस परिसर के भीतर, UPF1 आगे एक गैर RBP SMG1 द्वारा फॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय है, और इस तरह के UPF1 सक्रियण अंततः MRNA क्षय प्रेरित कारकों की भर्ती की ओर जाताहै 1,2. इस उदाहरण में, RBPs एनएमडी चलाता है कि RNP परिसर की भर्ती और सक्रियण के लिए गैर-RBP cofactors की आवश्यकता है। अभी तक RNPs की एक और संपत्ति उनकी compositional विषमता है. spliceosome पर विचार करें, जो अलग ई, ए, बी या सी परिसरों में मौजूद है. विभिन्न स्प्लेकसम परिसरों में अतिव्यापन और विशिष्ट प्रोटीन3होते हैं . आरएनपी कार्यों का अध्ययन करने के लिए, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि आरएनए एक आरबीपी और इसके संबद्ध प्रोटीन से बंधे हैं। इसे पूरा करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं , प्रत्येक दृष्टिकोण के पास इसके विशिष्ट फायदे और नुकसान4,5,6,7हैं .

आरबीपी बाइंडिंग स्थलों की पहचान करने के लिए व्यापक रूप से लोकप्रिय तरीके - इम्यूनोप्रीसेप्शन (CLIP) और इसके विभिन्न रूपों के बाद क्रॉसलिंकिंग - आरएनए8के लिए एक आरबीपी को क्रॉसलिंक करने के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश पर भरोसा करते हैं। तथापि, यह आरएनपी के भीतर गैर-आरएनपी के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण नहीं है, जो सीधे आरएनए से संपर्क नहीं करते हैं। यहाँ, हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि एक जैसे RBPs और गैर RBPs के लिए लागू होता है का वर्णन, को अलग करने और उनके आरएनए बाध्यकारी साइटों की पहचान. इस दृष्टिकोण को आरएनए इम्यूनोप्रीसेशन को अग्रानुक्रम (आरआईआईपीटी ) कहा जाता है , जिसमें दो इम्यूनोप्रीसिप्शन चरण होते हैं , जो एकल शोधन की तुलना में उच्च विशिष्टता प्राप्त करने में मदद करते हैं (चित्र 1) 9,10. चूंकि अलग-अलग इम्यूनोप्रीफ्ट (आईपी) कदम क्लिप की तुलना में कम स्ट्रिंगमेंसी पर किए जा सकते हैं, RIPIT एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर नहीं करता है जो इम्यूनोप्रीशंस के दौरान मजबूत डिटर्जेंट की उपस्थिति का सामना कर सकता है। RIPIT का सबसे अनूठा लाभ दो शुद्धि चरणों में दो अलग प्रोटीन को लक्षित करने की क्षमता है; यह इसी तरह के अन्य परिसरों11से एक compositionally अलग आरएनपी परिसर को समृद्ध करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है.

RIPIT प्रक्रिया के लिए छोटी विविधताओं आगे RNP संवर्धन में वृद्धि कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, आरएनपी के भीतर कुछ आरएनए प्रोटीन या प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन क्षणिक होते हैं और ऐसे परिसरों के पैरों के निशान को कुशलतापूर्वक शुद्ध करना मुश्किल हो सकता है। ऐसी बातचीत को स्थिर करने के लिए, RNPs सेल lysis और RIPIT से पहले formaldehyde के साथ कोशिकाओं के भीतर crosslinked किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि एक्सॉन जंक्शन परिसर (EJC) मुख्य कारक, EIF4AIII और EJC disassembly कारक के बीच एक कमजोर बातचीत, PYM12 formaldehyde उपचार के साथ स्थिर किया जा सकता है जैसे कि अधिक आरएनए पैरों के निशान समृद्ध कर रहे हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है) सेल हार्वेस्टिंग और RIPIT से पहले, कोशिकाओं को भी एक विशेष राज्य में RNPs को स्थिर या समृद्ध करने के लिए दवाओं के साथ इलाज किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन है कि अनुवाद के दौरान MRNA से हटा रहे हैं का अध्ययन (उदाहरण के लिए, EJC13, UPF114),अनुवाद अवरोधकों के साथ उपचार जैसे puromycin, cycloheximide या harringtonकेन की वृद्धि हुई अधिभोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आरएनए पर प्रोटीन.

RIPIT से बरामद आरएनए की मात्रा आमतौर पर कम है (0.5-10 pmoles, अर्थात्, 10-250 एनजी आरएनए 75 nt की एक औसत आरएनए लंबाई पर विचार). इस के लिए प्राथमिक कारण यह है कि केवल एक दिए गए प्रोटीन का एक छोटा सा अंश RNPs के भीतर अन्य प्रोटीन के साथ जटिल में मौजूद है (किसी भी "मुक्त" पहले कदम में IP'ed दूसरे आईपी के दौरान खो दिया है). इस आरएनए से आरएनए-सेक पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए, हम यहां पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुकूलन की रूपरेखा भी तैयार करते हैं जो ऐसे कम आरएनए आदानों के लिए उपयुक्त है15,16 (चित्र 2), जो 3 में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तैयार नमूनों की पैदावार करता है दिनों.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. स्थिर HEK293 सेल लाइन्स की स्थापना Tetracycline-inducable FLAG-टैग्ड प्रोटीन ब्याज की (POI) व्यक्त

  1. बीज HEK293 कोशिकाओं के साथ एक stably एकीकृत Flp पुनर्संयोजन लक्ष्य (FRT) साइट के घनत्व पर 10 x 104 कोशिकाओं / mL विकास के माध्यम में (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [डीएमईएम] + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS] + 1% पेनिसिलिन-streptomycin [pen/ अच्छी तरह से प्लेटें. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 (सभी बाद के चरणों के लिए मानक वृद्धि की स्थिति) पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में रात भर बढ़ने की अनुमति दें।
  2. अगले दिन, कोशिकाओं 70% confluent होना चाहिए. transfection reagent प्रोटोकॉल के अनुसार, PCDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44 के 9:1 अनुपात के साथ FRT साइट युक्त HEK293 कोशिकाओं transfect.
    नोट: FLAG टैग अनुक्रम आकृति DYKDDK (डी ] aspartic एसिड, Y ] tyrosine, और K ] lysine) है.
  3. 24 ज के बाद, एंटीबायोटिक चयन शुरू करें। मीडिया निकालें और ताजा विकास माध्यम जोड़ने के साथ पूरक 100 g/mL hygromycin. 72 ज के भीतर, अकर्मण्य कोशिकाओं को मरने के लिए शुरू कर देना चाहिए।
  4. हर 48-72 एच, विकास मीडिया बदलने के लिए और ताजा hygromycin के साथ पूरक.
  5. चयन के 2 सप्ताह के बाद, stably transfected कोशिकाओं के असतत कालोनियों प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा. एक बार कालोनियों नग्न आंखों के लिए दिखाई दे रहे हैं, थाली में trypsin के 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट. DMEM में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, एक नई 10 सेमी प्लेट में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, और 10 एमएल ताजा विकास माध्यम के लिए मात्रा को समायोजित करें 100 g/mL hygromycin के साथ पूरक। स्थायी स्टॉक तैयार करने के लिए कोशिकाओं का और विस्तार करने के लिए प्लेट को $80% संगम तक पहुंचने की अनुमति दें।
  6. प्रयोग के लिए FLAG-POI व्यंजक का इष्टतम स्तर प्राप्त करने के लिए आवश्यक टेट्रासाइक्लिन (Tet) की मात्रा निर्धारित करें। 12-वेल प्रारूप में कोशिकाओं को बढ़ाएं और 16-24 ज के लिए 0-1,000 एनजी/एमएल रेंज के बीच टीईटी का अनुमापन करते हैं। पीओआई के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अनुमापन नमूनों पर पश्चिमी धब्बा निष्पादित करें।
    नोट: $ 60 kDa तक प्रोटीन के लिए, FLAG-tagged और प्रोटीन के अंतर्जात प्रतिलिपि सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल electrophoresis पर हल किया जा सकता है (एसडीएस-पेज) FLAG-POI की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए अपने अंतर्जात समकक्ष. बड़ा प्रोटीन के लिए, Tet प्रेरित नमूनों में संकेत तीव्रता uninduced नमूना की तुलना में किया जा सकता है. टेट्रासाइक्लिन स्टॉक समाधान 100% इथेनॉल में 1 मिलीग्राम/एमएल पर तैयार किया जा सकता है। सेल संस्कृति के काम के लिए स्टॉक का फैलाव बाँझ पानी या फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में होना चाहिए। टेट्रासाइक्लिन स्टॉक को हर महीने एक बार ताजा तैयार किया जाना चाहिए।

2. टेट्रासाइक्लिन प्रेरण और RIPIT प्रक्रिया के लिए कक्षों की गणना

  1. 15 सेमी प्लेटों में विकास माध्यम में 3 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर बीज स्टफ-पीएचई HEK293 को एकीकृत किया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2में बढ़ने दें।
    नोट: सामान्य तौर पर, ब्याज के आरएनपी की बहुतायत के आधार पर आरएनए पदचिह्नों के 2-20 pmol तीन से पांच सेमी प्लेटें उपजेंगे। यदि RNPs formaldehyde crosslinked और कड़े शर्तों के तहत शुद्ध किया जाएगा, तो दो बार के रूप में ज्यादा इनपुट की आवश्यकता हो सकती है.
  2. FLAG-POI की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए मीडिया के लिए पूर्व निर्धारित इष्टतम एकाग्रता के लिए टेट्रासाइक्लिन जोड़ें (चरण 1.6 देखें) 16-24 h कोशिकाओं को काटा जाएगा से पहले।
    नोट: विकास माध्यम को बदलना आवश्यक नहीं है। कोशिकाओं को बोने के बाद लगभग 72 एच फसल के लिए तैयार होना चाहिए या जब प्लेटें $80% confluent हैं. कोशिकाओं को संप्रवाही बनने से रोकना महत्वपूर्ण है।

3. सेल हार्वेस्टिंग, फॉर्मेल्डिहाइड उपचार, और सेल Lysis

  1. प्रत्येक 15 सेमी प्लेट के लिए 15 एमएल ठंडा पीबीएस के साथ मोनोलेयर कोशिकाओं को धीरे से धो लें। फिर पीबीएस के 30 एमएल में कोशिकाओं को खत्म कर दिया। यदि कोशिकाओं को कटाई से पहले दवाओं के साथ इलाज किया गया, दवा के साथ पीबीएस पूरक. सभी कोशिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में लीजिए।
    नोट: कमजोर इंटरैक्शन के संरक्षण के लिए, कोशिकाओं को फॉर्मेल्डिहाइड के साथ क्रॉसलिंक किया जा सकता है: सेल निलंबन को चरण 3.1 से 0.1% की अंतिम सांद्रता में जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रॉकर पर इनक्यूबेट करें। शमन बफर के 3 एमएल जोड़ें (तालिका 1 ) और 5 अतिरिक्त मिनट के लिए रॉक.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर गोली कोशिकाओं और supernatant त्यागें।
  3. बर्फ-ठंडा hypotonic lysis बफर के 4 एमएल में Lyse कोशिकाओं (HLB; तालिका 1) कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें। एक 5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए बर्फ पर incubate lysate.
  4. एक बर्फ स्नान में lysate प्लेस और 2 s ठहराव के साथ 1 s दालों के साथ 30 s के लिए 10% आयाम पर sonicate. इसके बाद नमक की सांद्रता को 5 उ नाक्ल के 108 डिग्री सेल्सियस जोड़कर 150 उ. में समायोजित कीजिये।
    नोट: Formaldehyde crosslinked नमूने lysis बफर में एसडीएस और सोडियम deoxycholate के 0.1% प्रत्येक सहित द्वारा और अधिक कड़े lysis और शुद्धि के अधीन किया जा सकता है.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 21,000 x g पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा lysate साफ़ करें। इनपुट में प्रोटीन के स्तर के पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए लेबल ट्यूब में 20 ख्0एल सुपरनेंट (सेल निष्कर्ष) लीजिए (चित्र 3कदेखें)।
    नोट: जबकि lysate अपकेंद्रित्र में है, FLAG agarose मोती धोया जा सकता है (चरण 4.1 देखें). FLAG agarose मोती बर्फ ठंडा आइसोटोनिक धोने बफर के 4 एमएल में पूर्व धोया 3x होना चाहिए (IsoWB, तालिका 1).

4. FLAG इम्यूनोवेसेशन

  1. एक 5 एमएल ट्यूब में चरण 3.5 से 750 डिग्री सेल्सियस पूर्व धोया FLAG agarose मोती से शेष supernatant लागू करें (धोया FLAG agarose मोती के बिस्तर की मात्रा 375 डिग्री सेल्सियस हो जाएगा).। कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 एच के लिए इनक्यूबेट FLAG agarose मोती और सेल निकालने।
    नोट: FLAG agarose मोती की यह मात्रा प्रोटीन की एक विस्तृत रेंज के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन अनुकूलित किया जा सकता है, अगर जरूरत है.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली FLAG agarose मोती। समाप्त कोशिका निष्कर्ष में प्रोटीन के स्तर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक लेबल ट्यूब में supernatant के 20 डिग्री सेल्सियस लीजिए (चित्र 3एदेखें) . शेष महादलित को त्याग दें।
  3. FLAG agarose मोती धोने के लिए, IsoWB के 4 एमएल जोड़ें और फिर से शुरू. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर गोली मोती। ध्यान से supernatant निकालें. 4x दोहराएँ.
    नोट: formaldehyde crosslinked आईपी के कड़े washes के लिए, 0.1% एसडीएस और सोडियम deoxycholate के प्रत्येक पहले दो धोने चरणों के लिए धोने बफर में शामिल किया जा सकता है.

5. RNase मैं पाचन

  1. इसोडब्ल्यूबी के 750 डिग्री एल में 0.002-0.01 यूनिट/एमएल (वांछित पदचिह्न आकारों के लिए उपयुक्त सांद्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है) के लिए निरूपित RNase I को 0.002-0.01 यूनिट/ IsoWB-RNase मैं धोया FLAG agarose मोती और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिश्रण के साथ इनक्यूबेट जोड़ें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर गोली मोती। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक लेबल ट्यूब में 20 $L supernatant (RNase मैं elution) लीजिए. इसोWB-RNase I को छोड़दें और चरण 4.3 में वर्णित IsoWB के साथ FLAG agarose मोती 4x को धोएं।

6. आत्मीयता Elution

  1. इलुशन बफर का एक स्टॉक तैयार करें (इसोडब्ल्यूबी में 250 एनजी/एमएल पर FLAG पेप्टाइड)। FLAG agarose मोती के लिए elution बफर के 375 डिग्री सेल्सियस लागू करें और धीरे से हिला 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1-2 ज. गोली FLAG agarose मोती और FLAG आईपी में प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा के लिए elution के एक 15 $L alicot इकट्ठा (चित्र 3एदेखें )।
    नोट: जब आत्मीयता elution चल रहा है, धारा 7 किया जा सकता है.

7. चुंबकीय बीड-एंटीबॉडी संयोजन

  1. धो 50 $L चुंबकीय मोती (यानी, Dynabeads; सामग्री की तालिका) 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल IsoWB में 3x. चुंबकीय मोतियों को 100 डिग्री सेल्सियस कंजुकेशन बफर में पुन: निलंबित करें। एंटीबॉडी की उचित राशि जोड़ें (आईपी के लिए उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी की सटीक राशि अनुभवजन्य प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी)।
    नोट: प्रोटीन एक चुंबकीय मोती खरगोश में उत्पादित एंटीबॉडी के लिए इष्टतम हैं, जबकि प्रोटीन जी चुंबकीय मोती माउस एंटीबॉडी के लिए अधिक उपयुक्त हैं. चुंबकीय मोती संगतता चार्ट आपूर्तिकर्ता वेबसाइट पर उपलब्ध है प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त मोती का चयन करने के लिए.
  2. वॉश चुंबकीय मोती 2x संयोजन बफर में (तालिका 1)। कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट मिश्रण. RIPIT कमजोर पड़ने बफर के 375 डिग्री एल में चुंबकीय मोती को पुन: निलंबित करें। अगले कदम तक बर्फ पर स्टोर.

8. दूसरा इम्यूनोवेसेशन

  1. ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए युग्मित चुंबकीय मोती के लिए चरण 6.1 से शेष FLAG आत्मीयता elution लागू करें. 1-2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिश्रण के साथ इनक्यूबेट, चुंबकीय मोतियों को चुंबक पर कैप्चर करें और पश्चिमी दाग के माध्यम से असीमित प्रोटीन के विश्लेषण के लिए सुपरनेंट के 15 डिग्री सेल्सियस एकत्र करें। IsoWB के 1 एमएल के साथ चुंबकीय मोती 7x धो लो।

9. निराकरण Elution

  1. चुंबकीय मोती के लिए स्पष्ट नमूना बफर (तालिका 1) के 100 डिग्री एल जोड़ें और एक P200 पाइपेट के साथ पुन: स्कटलें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें. समय-समय पर मोती को फिर से चालू करने के लिए धीरे से फ़्लिक करें।
  2. चुंबकीय मोतियों को चुंबक पर ठहरें और पश्चिमी धब्बा के माध्यम से RIPIT elution में प्रोटीन के विश्लेषण के लिए 15 डिग्री सेल्सियस एल्यूशन एकत्र करें (चित्र 3कदेखें )। एक नया लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में शेष elution स्थानांतरण.
    नोट: यदि नमूने formaldehyde crosslinked थे, तो नमूने crosslinking रिवर्स करने के लिए 1 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए।
  3. विभिन्न चरणों पर एकत्र नमूनों पर पश्चिमी blots प्रदर्शन (इनपुट, FLAG आईपी कमी, FLAG आईपी, दूसरा आईपी कमी, दूसरा आईपी elution). दो चारा प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ब्लॉट, उनके अन्य interactors यदि जाना जाता है, और कम से कम एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक गैर बातचीत RBP (चित्र 3ए).

10. आरएनए निष्कर्षण और अंत इलाज

  1. RIPIT elution करने के लिए, RNase-मुक्त डीडीएच2ओ के 320 $L जोड़ें, 400 डिग्री फीनॉल-क्लोरोफॉर्म आइसोमिल अल्कोहल (PCIAA, पीएच 4.5) के लिए भंवर और कमरे के तापमान पर 12,000 x ग्राम पर स्पिन 5 मिनट के लिए। एक ट्यूब में 350 डिग्री सेल्सियस चरण के लिए ले लीजिए 350 डिग्री सेल्सियस। 3 एम सोडियम ऐसीटेट का 35 डिग्री एल, 1 एम एमजीसीएल2का 1 डिग्री एल, ग्लाइकोजन का 10 डिग्री ग्राम, और 100% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. गोली आरएनए के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रित्र। 70% इथेनॉल में आरएनए धो एंको.
  3. RNase मैं दरार के बाद आरएनए पर छोड़ दिया 3' फॉस्फेट को दूर करने के लिए, आरएनए-मुक्त डीडीएच2हे के 17 डिग्री एल में आरएनए गोली को पुन: स्फूर्त करें, और 10x T4 पॉलीन्यूक्लिओटाइड किनेस (PNK) बफर (सामग्रीकीतालिका) और T4 PNK के 1 डिग्री एल जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: 3'फॉस्फेटस गतिविधि T4 PNK के पीएच 617पर इष्टतम गतिविधि है. PNK प्रतिक्रिया बफर T4 PNK के 5' kinase गतिविधि के लिए अनुकूलित है और 7.6 का पीएच है. अंत-curing प्रतिक्रिया के पीएच का समायोजन करते समय का प्रयास किया गया है, इस कदम को आगे अनुकूलित किया जा सकता है.
  4. RNase मुक्त ddH2O के 380 $L जोड़ें और 400 $L PCIA pH 4.5 ट्यूब के लिए. 30 s के लिए भंवर, 12,000 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रण. जलीय चरण एकत्र करें और 3 एम सोडियम एसीटेट के 35 डिग्री सेल्सियस, 1 M MgCl2के 1 $L, ग्लाइकोजन के 10 डिग्री ग्राम, और 100% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। गोली और ऊपर के रूप में 70% इथेनॉल के साथ आरएनए धोने. आरएनए-मुक्त जल के 4.5 डिग्री एल में आरएनए को पुन: निलंबित करें।

11. आरएनए पदचिह्न आकार और बहुतायत का अनुमान

  1. एक सफल RIPIT 1 pmol या आरएनए टुकड़े के अधिक उपज की उम्मीद है. वास्तविक उपज की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक नई ट्यूब में RIPIT आरएनए ($1/6 कुल उपज का$1/6) के 0.7 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण। 10x T4 PNK बफर के 2 $L जोड़ें, 1 $L 1 MM एटीपी के 1 $L, 40 [Ci ]32P-ATP (0.5 $1.0 $L स्टॉक के), और T4 PNK के 1 $L जोड़ें। मात्रा को 10 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. समानांतर PNK प्रतिक्रियाओं में, एक कम रेंज डीएनए सीढ़ी लेबल और एक सिंथेटिक आरएनए या डीएनए ओलिगो के 0.1 pmol (20-40 nt) एक आकार और मात्रा मानकों का उपयोग करने के लिए.
  2. 26% यूरिया-पेज जेल (20 x 27 x 0.45 मिमी3) पर लेबल आरएनए/डीएनए का समाधान करें। जेल पूर्व चलाने से पहले 35 डब्ल्यू फ्लश कुओं पर 30 मिनट के लिए पूर्व रन होना चाहिए और नमूने लोड करने से पहले और 35 डब्ल्यू पर चलाने से पहले जब तक ब्रोमोफेनोल नीले रंग का रंग सामने लगभग जेल के अंत तक पहुँच गया है.
  3. ध्यान से 8 x 11 इंच फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर कांच की प्लेटों से जेल निकालें। कागज के शीर्ष पर जेल के साथ, जेल सुखाने के उपकरण में जगह है और प्लास्टिक की चादर का एक टुकड़ा के साथ कवर. वैक्यूम के साथ 1 एच के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी जेल।
  4. रात भर या पर्याप्त संकेत का पता चला है जब तक एक फॉस्फोस्क्रीन के लिए सूखे जेल का पर्दाफाश. छवि फॉस्फोस्क्रीन. एक RIPIT से अच्छी गुणवत्ता आरएनए लेन में एक धब्बा के रूप में प्रकट होना चाहिए, कम से कम प्रमुख बैंड के साथ (चित्र 3बी) . आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, RIPiT लेन में वांछित आकार आरएनए टुकड़े के संकेत तीव्रता की तुलना लेबल सिंथेटिक ओलिगो के 0.1 pmol से संकेत करने के लिए।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, आरएनए पदचिह्न आकार और मात्रा एक उच्च संवेदनशीलता bioanalyzer का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है (चित्र 3ब्) .

12. एडाप्टर लिगेशन

  1. RIPIT आरएनए ऐसी है कि आरएनए के कम से कम 3 टंपोल 3ण्8 डिग्री सेल्सियस जल में भंग कर दिया है।
  2. 0ण्2 एमएल बहुलक श्रृंखला अभिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब में, आरएनए के 3.8 डिग्री एल, मिR-कैट-33 पूर्व-एडेनलेट एडाप्टर (7 डिग्री सेल्सियस) (सामग्री की सारणी) का 1 डिग्री सेल्सियस का संयोजन करें। 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिलर पर मिश्रण इनक्यूबेट करें, 5 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: पूर्व-adenylated लिंकर या तो ओलिगो संश्लेषण सेवा से आदेश दिया जा सकता है, या किसी भी ओलिगो संश्लेषण सेवा से एक कस्टम unadenylated डीएनए ओलिगो Mth RNA ligase (सामग्री की तालिका) और जेल शुद्ध का उपयोग कर adenylated किया जा सकता है।
  3. एक ही ट्यूब के लिए, 10x T4 आरएनए लिगास बफर के 1.5 डिग्री एल, 50% polyethylene ग्लाइकोल 8000 (PEG-8000), 20 m dithiothreitol के 0.75 $L (सामग्री की0.45 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें।
    नोट: 50% खूंटी-8000 आरएनए लिगेज और बफर खरीदा के साथ आता है। खूंटी-8000 समाधान चिपचिपा होते हैं और धीरे-धीरे पाइप ेट किए जाने चाहिए।
  4. थर्मल चक्र में इनक्यूबेट अभिक्रिया 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 ज के लिए, ऊष्मा 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर लिगेज को निष्क्रिय करती है, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ती है।

13. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. चरण 12-4 से लिगेशन मिश्रण के साथ ट्यूब में, 4x deoxynucleotide ट्राइफॉस्फेट (dNTP) मिश्रण के 11.25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, जिसमें नियमित और बायोटिनीलेटिड डीएनटीपी का मिश्रण होता है (तालिका 1देखें), 10 डिग्री सेल्सियस आरटी प्राइमर (सामग्रीकीतालिका) और 6.8 डिग्री एल का मिश्रण है। RNase मुक्त पानी. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  2. बर्फ के लिए स्थानांतरण ट्यूब और MgCl2 के बिना 5x प्रथम-खंड (FS) बफर के 9.0 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए (तालिका 1), 100 एमएम डीटीटी के 2.25 डिग्री सेल्सियस, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम के 1.2 डिग्री एल 45 डिग्री एल (सामग्री की तालिका) के अंतिम मात्रा में ।
  3. 30-60 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट करें। हीट में रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस को 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए निष्क्रिय करें और नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

14. आरटी उत्पाद का शुद्धिकरण

  1. 2x यूरिया लोड बफर ( सारणी1) का 45 डिग्री लल RT अभिक्रिया में जोड़ें। 45 डिग्री सेल्सियस में एक कम रेंज डीएनए सीढ़ी के 1 डिग्री ग्राम को पतला करें और 2x यूरिया लोड बफर के 45 डिग्री एल जोड़ें।
  2. 10% यूरिया-पेज जेल तैयार करें (20 x 28 x 0.15 cm3; तालिका 1) 8 अच्छी तरह से कंघी के साथ. सिरिंज या पाइप का उपयोग करना, 0.5x Tris/borate/EDTA (TBE) बफर के साथ कुओं फ्लश।
    नोट: ऊपर घर का बना जैल unextended आरटी प्राइमर से विस्तारित आर टी उत्पाद को अलग करने में बेहतर संकल्प प्रदान करते हैं. एक विकल्प के रूप में, पूर्व कास्ट यूरिया-पेज जैल भी इस्तेमाल किया जा सकता है (सामग्री कीतालिका). के रूप में पूर्व कास्ट जैल प्रति अच्छी तरह से छोटे अधिकतम मात्रा की अनुमति है, तो नमूने कई कुओं में विभाजित करने की आवश्यकता होगी. प्री-कास्ट जैल को 150 डिग्री 200 वी पर चलाया जाना चाहिए।
  3. 35 W पर 35 W पर पूर्व चलाने के लिए 30 मिनट फ्लश कुओं फिर से, लोड नमूने और 35 डब्ल्यू पर जेल चलाने जब तक ब्रोमोफेनोल नीले रंग का सामने जेल के अंत से लगभग 1 इंच के लिए चले गए हैं.
    नोट: पूर्व रन और जेल overheating को रोकने के लिए अंतिम रन के दौरान धातु गर्मी सिंक का प्रयोग करें।
  4. 0.5x TBE में तैयार 1x सोने न्यूक्लिक एसिड जेल दाग समाधान में 5 मिनट के लिए जेल दाग. यह डाई प्रकाश संवेदनशील है, इसलिए प्रकाश जोखिम से बचें।
  5. 520 एनएम उत्तेजना और 580 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर प्रलेखन प्रयोजनों के लिए फ्लोरोसेंट स्कैनर पर छवि जेल. यदि फ्लोरोसेंट स्कैनर अनुपलब्ध है, तो नीले प्रकाश ट्रांसिलल्युमिनेटर का उपयोग करें. आरटी उत्पाद एक स्मीयर के रूप में प्रकट होना चाहिए जो अनएक्सडकियाड आरटी प्राइमर के ऊपर शुरू होता है (चित्र 4) ।
    नोट: हालांकि सोने न्यूक्लिक एसिड जेल धुंधला डाई आसानी से यूवी प्रकाश स्रोत के साथ एक जेल डॉक्टर पर कल्पना की है, यह नुकसान को रोकने के लिए यूवी करने के लिए मूल्यवान आरटी उत्पाद का खुलासा नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. एक नीले प्रकाश transilluminator पर जेल कल्पना और जेल से आरटी उत्पाद उत्पाद. डीएनए को 30-200 nt (चित्र 4) से लेकर विस्तार के साथ काटने की सिफारिश की जाती है। एक साफ सतह पर excised जेल टुकड़े प्लेस और सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए छोटे टुकड़ों में टुकड़ा कीमा। ध्यान से 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें तथा डीएनए एल्यूशन बफर के 800 डिग्री सेल्सियस को जोड़ें (सारणी 1)।
  7. कमरे के तापमान पर रात में डीएनए elution बफर के साथ कोमल मिश्रण के साथ जेल टुकड़े इनक्यूबेट करें।
  8. एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखा एक सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर कॉलम (सामग्री की तालिका) के माध्यम से घोल गुजर द्वारा जेल से elution बफर अलग.
  9. 1ण्5 एमएल ट्यूब में स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मनकों की 10 डिग्री सेल्सियस को धोएं, जिसमें स्ट्रेप्टाविडिन मनका वाण बफर (सारणी 1) की 500 डिग्री सेल्सियस थी। तीन कुल washes के लिए दोहराएँ. मनकों को सूखने न दें। डीएनए एल्यूशन बफर के 10 डिग्री एल में मनकों को पुन: स्फूर्त करना (सारणी 1) ।
  10. एल्यूशन बफर को चरण 14.8 में जेल के टुकड़ों से धोया स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोती युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  11. कमरे के तापमान पर कम से कम 8 एच के लिए कोमल मिश्रण के साथ इनक्यूबेट। एक चुंबक पर मोती पर कब्जा, supernatant को हटाने और RNase मुक्त पानी के 10 डिग्री एल में चुंबकीय मोती resuspend और एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए स्थानांतरण.

15. आरटी उत्पाद का परिपत्रीकरण

  1. STReptavidin मोती पर कब्जा कर लिया आरटी उत्पादों परिपत्र कर रहे हैं, जबकि मोती पर बाध्य. चुंबकीय मनका घोल में, 10x सर्कुलररिओशन प्रतिक्रिया बफर के 2.0 डिग्री एल, 1.0 डिग्री एल 1 एम एम एटीपी, 50 एम एम एमएनसीएल2के 1.0 डिग्री एल, 5 एम बीटाइन के 4.0 डिग्री एल, एसडीएनए लिगास I के 1.0 एल (सामग्रीकीतालिका), और 1.0 एल आर.एन.एस-फ्री पानी जोड़ें।
  2. एक तापीय चक्रपरक पर वृत्ताकार अभिक्रिया को 4 ज के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूबेट करें। ऊष्मा एसडीएनए लिगेज I को 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके निष्क्रिय कर देती है और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ती है।

16. टेस्ट पीसीआर

  1. एक बड़े पैमाने पर PCR करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, प्रत्येक नमूने के लिए प्रवर्धन चक्र के आदर्श संख्या निर्धारित करने के लिए परिपत्र उत्पाद के एक हिस्से का उपयोग करें. यह चरण अधिक-प्रवर्धन को रोकने और पीसीआर प्रतिक्रिया घटकों उच्च पीसीआर चक्र पर सीमित हो जाते हैं के रूप में पीसीआर कलाकृतियों को सीमित करने में मदद करता है।
  2. परिपत्रित उत्पाद के 4.0-6.0 डिग्री सेल्सियल के साथ 45 डिग्री सेल्सियल की प्रतिक्रिया तैयार करें, 5x प्रतिक्रिया बफर के 9.0 $L, 0.9 $L 10 M DNTPs, 10 के 2.25 L PE1.0 प्राइमर (सामग्री की तालिका), 2.25 डिग्री सेल्सियस पीई2.0 प्राइमर ( सामग्रीकीतालिका ) , और उच्च निष्ठा डीएनए पॉलिमरेज ( सामग्रीकी तालिका) और पानी के 0.045 डिग्री सेल्सियस.
  3. अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिलाएं और तीन 15 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रियाओं में विभाजित. इन तीन प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक पीसीआर चक्र के एक चर संख्या के अधीन हो जाएगा. चक्र की आदर्श संख्या 7 और 14 के बीच होने की उम्मीद है. तो 8, 11, और 14 चक्र के लिए परीक्षण पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
  4. निम्नPC शर्तों का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस - 30 s; 98 डिग्री सेल्सियस - 5 s; 65 डिग्री सेल्सियस - 10 s; 72 डिग्री सेल्सियस - 15 s; 72 डिग्री सेल्सियस - 2 मिनट; 12 डिग्री सेल्सियस - पकड़।
  5. जोड़ें 6x जेल लोड हो रहा है डाई के 3 $L और 10% देशी पेज जेल पर हल जब तक नीले रंग सामने जेल के 3/ सोने के न्यूक्लिक एसिड जेल दाग और छवि का उपयोग कर जेल दाग के रूप में कदम 14.4 और 14.5 (चित्र5) में.
  6. PCR चक्र की आदर्श संख्या का चयन करने के लिए, चक्र की बढ़ती संख्या से पीसीआर उत्पादों की तुलना करें. चक्र संख्या है कि overamplification कलाकृतियों के बिना अपेक्षित आकार के उत्पाद की सबसे बड़ी राशि पैदावार चुनें (उदाहरण के लिए, डीएनए स्मीयर बहुत उम्मीद उत्पाद से बड़ा है, और जहां PE1.0 और PE2.0 प्राइमर की कोई प्रशंसनीय कमी देखा जाता है (में लाल तीर देखें चित्र 5) .

17. बड़े पैमाने पर पीसीआर

  1. चरण 16.2 के रूप में, एक 45 डिग्री एल पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें और पीसीआर को दोहराएं। 150 वी पर 10% देशी पृष्ठ पर पीसीआर को हल, एक नीले प्रकाश transilluminator पर 1x सोने न्यूक्लिक एसिड जेल दाग और छवि के साथ दाग.
  2. जेल से पीसीआर उत्पाद उत्पाद शुल्क और एक 3 एमएल सिरिंज करने के लिए स्थानांतरण। जेल को कुचलने के लिए सिरिंज का उपयोग करें और 1.5 एमएल ट्यूब में बाहर निकालें।
    नोट: परिपत्रीकरण पर unextended आरटी उत्पाद 151 बीपी के पीसीआर उत्पाद पैदावार। इस प्रकार, इस चरण में एक का आकार उन उत्पादों का आकार होना चाहिए जो 151 बीपी से बड़े हैं (चित्र 6)।
  3. डीएनए elution बफर और कोमल मिश्रण के साथ रात भर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट के 900 डिग्री एल जोड़ें।
  4. एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखा एक सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर कॉलम के लिए जेल घोल स्थानांतरण। 3 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर स्पिन, एक ताजा ट्यूब में supernatant इकट्ठा.
  5. कुचल जेल के लिए डीएनए elution बफर के एक और 400 $L जोड़ें और एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण. एक दूसरे elution के लिए एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए कोमल मिश्रण के साथ इनक्यूबेट.
  6. सभी elutions पूल और 400 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक के साथ 3 ट्यूबों में विभाजित. 100% इथेनॉल के 1 एमएल और ग्लाइकोजन के 10 डिग्री ग्राम जोड़कर डीएनए की पूर्वनिर्धारित करें। भंवर और इनक्यूबेट -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 एच।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर गोली डीएनए। 70% इथेनॉल के साथ डीएनए गोली धोएं।
  8. ध्यान से pipeting द्वारा सभी इथेनॉल को हटाने और जल्दी से पानी के 20 डिग्री एल में डीएनए गोली resuspend.
    नोट: इस स्तर पर, डीएनए गोली को सूखा नहीं होने देना महत्वपूर्ण है, क्योंकि डीएनए को सुखाने से यह विकृत हो सकता है।
  9. FLUorometer और उच्च संवेदनशीलता डीएनए bioanalyzer के माध्यम से आकार और पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए डीएनए नमूने के एक छोटे से हिस्से का उपयोग करें. नमूने अब प्लेटफार्मों में से एक पर अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है.
  10. अनुक्रम पढ़ता संसाधित किया जा सकता है (जैसे, एडाप्टर हटाने, दृश्यों रखने के लिए trimming और gt;30 Phred स्कोर), संदर्भ जीनोम के लिए गठबंधन किया है, और इस तरह के UCSC जीनोम ब्राउज़र के रूप में एक ब्राउज़र पर कल्पना (चित्र 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक सफल RIPIT ब्याज और अन्य ज्ञात बातचीत प्रोटीन के दोनों प्रोटीन के इम्यूनोप्रीफिक में परिणाम होगा, और गैर बातचीत प्रोटीन की अनुपस्थिति. जैसा कि चित्र 3एमें देखा गया है, दोनों मागोह और EIF4AIII को RIPIT elution में पाया गया था, लेकिन HNRNPA1 (लेन 6) नहीं था। समानांतर में, आरएनपी परिसरों के साथ सह-शुद्ध किए गए आरएनए पदचिह्नों का पता ऑटोरेडियोग्राफी (चित्र 3ख) या बायोएक्लेयरेटर (चित्र 3ब्) के माध्यम से लगाया गया था। Puromycin उपचार आरएनए पर EJC अधिभोग में वृद्धि की उम्मीद है, और एक मजबूत आरएनए पदचिह्न संकेत चित्रा 3बी में Puromycin इलाज RIPIT में मनाया गया था (लेन 2 और 3 की तुलना में). गहरी अनुक्रमण के लिए नमूने उत्पन्न आरएनए के लिए एक एडाप्टर ligating की आवश्यकता है, और फिर एक प्राइमर है कि एडाप्टर अनुक्रम के लिए anneals का उपयोग कर डीएनए में आरएनए transcribing रिवर्स. रिवर्स प्रतिलेखन कदम biotinylated न्यूक्लिओटाइड शामिल, रिवर्स प्रतिलेखन उत्पाद की शुद्धि के लिए. रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, उत्पाद यूरिया-पेज (चित्र 4) द्वारा अनएक्सडिक्टकिएड एडाप्टर से अलग होना चाहिए। रिवर्स प्रतिलेखन उत्पाद तो परिपत्र और पीसीआर प्रवर्धित है. पीसीआर चक्र की उचित संख्या परिपत्र उत्पाद overamplify नहीं करना चाहिए। अतिविक्षिप् ति के परिणामस्वरूप प्राइमर अवक्षय और विपथी पीसीआर उत्पाद (चित्र 5, लेन 4) देखें। अतिवर्धन के साक्ष्य के बिना सबसे बड़ा प्रवर्धन के साथ चक्रों की संख्या एक बड़े पैमाने पर पीसीआर के लिए उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त है (चित्र 5 लेन 3 और चित्र 6)।

Figure 1
चित्र 1 : RIPIT में मुख्य कदम रूपरेखा योजनाबद्ध. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3

चित्र 2 : उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों में RIPIT आरएनए के रूपांतरण के लिए कार्यप्रवाह का चित्रण Schematic. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2

चित्र 3 : आरएनए और प्रोटीन की पैदावार का अनुमान RIPIT से. (क) रिपिट प्रक्रिया में प्रत्येक प्रमुख चरण से शुद्ध प्रोटीनों का पश्चिमी दाग। (ख) एक FLAG-MAGOH:EIF4AIII RIPIT से आरएनए पैरों के निशान की ऑटोरेडियोग्राफ छवि प्यूरोमाइसिन उपचारित और अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना करती है। लाल बॉक्स आरएनए पदचिह्न आकार है कि अंततः अनुक्रमण पुस्तकालयों में परिवर्तित हो जाएगा इंगित करता है। (ग) आरआईआईपीटी से प्राप्त आरएनए की प्रोफाइल जो कि पैनल बी में लेन 2 में है, जब बायोएनाल्सर का उपयोग करके कल्पना की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) उत्पाद एक 10% यूरिया-पेज जेल पर हल और सोने न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ दाग। लाल बॉक्स विस्तारित आरटी उत्पादों के जेल शोधन के लिए उत्पादित जेल क्षेत्र को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : टेस्ट पीसीआर 8% गैर-denaturing पृष्ठ पर हल. 14 चक्रों (लाल बॉक्स) और प्राइमर (लाल तीर) की समानांतर अवक्षय पर प्रकट होने वाले aberantly बड़े PCR उत्पादों को नोट करें जो overamplification का संकेत है। इस नमूने के लिए, 11 चक्र बड़े पैमाने पर PCR (नीले बॉक्स) के लिए चुना गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : बड़े पैमाने पर पीसीआर 8% गैर-denaturing पृष्ठ पर हल. लाल बॉक्स जेल शोधन के लिए excised जेल टुकड़ा इंगित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 : एक RIPIT से प्रतिनिधि परिणाम के रूप में MAGH-MAGOH:EIF4AIII पदचिह्नों के वितरण दिखा MAPK1 जीन के जीनोम ब्राउज़र स्क्रीनशॉट. लाल तीर अपेक्षित विहित EJC बाइंडिंग साइटों को निरूपित करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Pbs 137 एमएम नैक्ल
2.7 एम.एम.के.एल.
10 mM ना2HPO4$7H2हे
KH2पीओ4
पीएच 7.4
Quenching बफर 2.5 एम ग्लिसिन
2.5 एमएम ट्रिस-बेस
Hypotonic Lysis बफर (HLB) 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5
15 एमएम नैक्ल
10 एमएम EDTA
0.5% IGEPAL
0.1% ट्राइटन-एक्स-100
1x एप्रोटिनिन*
1x लेप्टिन*
1x पेपस्टेटिन*
1 एम एम पी एस एफ (फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड)*		 * हर बार ताजा जोड़ा जाना चाहिए
आइसोटोनिक वॉश बफर (IsoWB) 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5
150 एमएम नैक्ल
0.1% IGEPAL
संयोजन बफर 0.02% पॉलीसर्बेट-20
1x पीबीएस
नमूना बफर साफ़ करें 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.8
4% एसडीएस
10 एमएम EDTA
4xdNTPmix 0.25 एमएम डीजीटीपी
0.25 एम एम डीटीपी
0.175 एम एम डीएटीपी
0.1625 एम डी सी टी पी
0.075 एम बायोटिन-डीएटीपी
0.0875 एम बायोटिन-डीसीटीपी
5x पहले-स्ट्रैंड बफर w/o MgCl2 250 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8
375 एमएम केसीएल
RIPIT तनुता बफर (1 एमएल) 1 एमएल इसोडब्ल्यूबी
5 $L 200x बीएसए
20 $L 10% ट्राइटन-एक्स-100
20 डिग्री एल 0.5 एम EDTA
1x एप्रोटिनिन*
1x लेप्टिन*
1x पेपस्टेटिन*
1 एम एम पीएमएसएफ*		 * हर बार ताजा जोड़ा जाना चाहिए
2x denaturing लोड बफर 3 एमएल 5x TBE
1.8 जी फिकॉल प्रकार 400
6.3 ग्राम यूरिया
3 मिलीग्राम ब्रोमोफेनोल नीला
3 मिलीग्राम जाइलीन सायनॉल
वॉल्यूम को 15 एमएल डीडीएच2हे में समायोजित करें		 घोल में जाने के लिए, ट्यूब को बीकर में रखिये और गर्म प्लेट पर 10-15 मिनट तक उबालें। मात्रा को 15 एमएल तक समायोजित करने के बाद रंगों को मिला कर उबाल लें।
यूरिया-पेज जेल 6 एम यूरिया
Acrylamide:bisacrylamide (40% [w/v]) उचित प्रतिशत के लिए
0.5x TBE
0.01% TEMED
डीएनए Elution बफर 300 एमएम नैक्ल
1 एमएम EDTA
Streptavidin मोती धो बफर 0.5 एम नाओह
20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5
1 एमएम EDTA

तालिका 1: बफ़र्स.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम RIPIT सफलतापूर्वक करने के लिए यहाँ कुछ महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा करें। सबसे पहले, व्यक्तिगत आईपी प्रत्येक कदम पर उच्चतम संभव दक्षता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. यहाँ वर्णित कोशिकाओं के इनपुट संख्या के लिए FLAG agarose मोती की राशि प्रोटीन हम परीक्षण किया है की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मजबूत साबित हो गया है. के रूप में केवल साथी प्रोटीन का एक छोटा सा अंश सह-immunoprecipitated है FLAG प्रोटीन के साथ, कुशल दूसरे आईपी के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा आमतौर पर कम है (कम से कम 10 डिग्री). छोटे पैमाने पर RIPIT (एक 10 सेमी प्लेट से) दो इम्यूनोप्रीफ्ट चरणों के दौरान प्रत्येक अंश में प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा सत्यापन के बाद स्केलिंग से पहले प्रक्रिया की दक्षता और विशिष्टता का आकलन करने के लिए अत्यंत उपयोगी साबित होता है। दोनों लक्षित प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिसर में किसी भी अन्य अपेक्षित बातचीत प्रोटीन elution में पता लगाया जाना चाहिए. यह भी समाप्त lysates में प्रोटीन के लिए परख के लिए फायदेमंद है (FLAG-agarose या चुंबकीय मोती के लिए असीमित) इम्यूनोप्रीफिजिंस दक्षता का एक अच्छा अनुमान है और प्रोटीन का प्रतिशत एक जटिल में कोडांतरण. इसके अतिरिक्त, यह विश्लेषण यह भी सूचित करता है कि क्या आरएनसे पाचन स्थितियों को आरएनए-निर्भर अन्योन्यक्रियाओं को आरएनए-स्वतंत्र अन्योन्यक्रियाओं से अलग करने के लिए पर्याप्त है। इसलिए, यह बस के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है, आदर्श एक RBP ब्याज की RNP करने के लिए असंबंधित. उदाहरण के लिए, चित्र 3कमें, HNRNPA1 इनपुट में मौजूद है लेकिन RIPIT elution में नहीं पाया गया है। HNRNPA1 एक RBP है कि सीधे EJC के साथ बातचीत नहीं करता है, लेकिन EJC के साथ परोक्ष रूप से सूचना का आदान-देना जब EJC और HNRNPA1 एक ही आरएनए अणु के लिए बाध्य कर रहे हैं. elution में नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन की जांच या तो गरीब RIPIT विशिष्टता या अपर्याप्त आरएनए पदचिह्न इंगित करता है. ऐसे मामले में, प्राप्त आरएनए पदचिह्न ों को पूरी तरह से ब्याज के प्रोटीन के पैरों के निशान को प्रतिबिंबित नहीं करेगा। आकार के पैरों के निशान 50-200 nt बाद में आरएनए-सेक के लिए सिफारिश कर रहे हैं. RNase मैं उपचार की अवधि या इस्तेमाल एंजाइम की मात्रा वांछित आकार पैरों के निशान प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ध्यान दें कि सबसे अच्छा मामला परिदृश्य वांछित आकार श्रेणी में अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए किया जाएगा, और यह भी सबसे इष्टतम स्थितियों में अब और कम RNAs है करने के लिए अपरिहार्य है. RIPIT भी एक RBP की बाध्यकारी साइटों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ऐसे मामले में, एक ही प्रोटीन को दो अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिट किया जा सकता है, पहले एक एफ़िनिटी टैग के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है और फिर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ18. अंत में, एक नकारात्मक नियंत्रण RIPIT एक FLAG टैग ्ड नियंत्रण प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं से समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है (जैसे, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) दूसरे आईपी में एक असंबंधित प्रोटीन के खिलाफ एक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संयोजन में.

इसके कई फायदे के बावजूद, यह RIPIT दृष्टिकोण की कुछ सीमाओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, और संभव उपचार. पहले शुद्धि के बाद आत्मीयता के विकास की आवश्यकता एक टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जैविक स्रोत की आवश्यकता है. यदि कोई साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन प्रणाली कोशिका रेखा या ब्याज के जीव में उपलब्ध नहीं है, तो CRISPR/Cas-आधारित जीनोम संपादन दृष्टिकोण19का उपयोग करके अंतर्जात जीन टिड्डी पर एक छोटी समानता टैग जैसे FLAG टैग (8 एमिनो एसिड) को पेश किया जा सकता है। FLAG टैग इस दृष्टिकोण के लिए एक आदर्श epitope है, क्योंकि FLAG एंटीबॉडी आत्मीयता elution के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और उच्च आयनिक शक्तियों और हल्के denaturing शर्तों है कि formaldehyde crosslinking के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता सामना कर सकते हैं. RIPiT दृष्टिकोण की एक और सीमा सेलुलर सामग्री का एक बड़ा इनपुट के लिए आवश्यकता है. यह कुछ हद तक अपरिहार्य रह सकता है क्योंकि आरबीपी का केवल एक छोटा सा प्रतिशत आरएनपी में अन्य प्रोटीन के साथ सूचना का आदान-देना करता है। अभी भी बेहतर पुस्तकालय तैयारी दृष्टिकोण बड़े इनपुट आवश्यकता को नीचे लाने में मदद कर सकते हैं. इन चरणों को और अधिक कारगर बनाने के लिए संभावित विचारों में आरएनए 3'-एंड डेफॉस्फोरिलेशन और एडाप्टर लिगेशन को दूसरे आईपी washes के तुरंत बाद और आरएनपी के अंतिम हल के बाद चुंबकीय मोती पर ले जाना शामिल है। इस तरह के एक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक वर्तमान CLIP-सेक प्रक्रियाओं में और RIPIT20की हाल ही में वर्णित भिन्नता में लागू किया गया है। इस तरह के परिवर्तन भी पुस्तकालय की तैयारी प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों से कई समय लेने वाली आरएनए शुद्धि कदम निकाल देंगे। इसके अलावा, CLIP के विपरीत, जो आरएनए पर एक आरबीपी के क्रॉसलिंकिंग साइट का न्यूक्लिओटाइड स्तर संकल्प प्रदान करता है, RIPIT पदचिह्नों का संकल्प न्यूक्लिओटाइड के दसियों के स्तर पर रहेगा। अंत में, के रूप में RNPs कई RBPs शामिल हो सकते हैं, RIPIT समृद्ध आरएनए साइटों कई RBPs के बाध्यकारी साइटों का एक मिश्रण शामिल हैं. के रूप में आम सहमति दृश्यों व्यक्तिगत RBPs द्वारा बाध्य एक तेजी से बढ़ती गति से खुला जा रहा है और अब आसानी से उपलब्ध हैं21,22,23, इस जानकारी का लाभ उठाया जा सकता है RBP साइटों के वर्गीकरण deconvolve RIPIT outputs में समृद्ध. इन चुनौतियों के बावजूद, RIPIT-सेक गतिशील, विषम, और यहां तक कि क्षणिक RNP परिसरों, जो आरएनए मशीनरी है कि सेलुलर नियंत्रण के भीतर कामकाज में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं के आरएनए पैरों के निशान पर कब्जा करने के लिए एक प्रभावी प्रक्रिया है समारोह.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस कार्य को NIH अनुदान GM120209 (जी एस) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों उनकी सेवाओं के लिए OSUCCC जीनोमिक्स साझा संसाधन कोर धन्यवाद (सीसीसी समर्थन अनुदान NCI P30 CA16058).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-FLAG Affinity Gel Sigma A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi PerkinElmer BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) Fisher 14-823-435
Betaine 5M Sigma B0300
biotin-dATP TriLink N-5002
biotin-dCTP Perkin Elmer NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1 Branson
CircLigase I VWR 76081-606 ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11995-065
DNA load buffer NEB NEB
Dynabeads Protein A LifeTech 10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line ThermoFisher R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder ThermoScientific FERSM1203
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well Bio-Rad 4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel Bio-Rad 4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent Mirus MIR 6004
Mth RNA ligase NEB E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) Fisher BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEB NEB #7025
Q5 DNA Polymerase NEB M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U Eppicenter N6901K
SPIN-X column Corning CLS8160-24EA
Streptavidin beads ThermoFisher 60210
Superscript III (SSIII) ThermoScientific 18080044 reverse transcriptase enzyme
SybrGold ThermoFisher S11494 gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U NEB M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q NEB M0351S
Tetracycline Sigma 87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase NEB M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular Imager GE Healthcare Life Science 29187191

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Tags

जेनेटिक्स अंक 149 आरएनए पदचिह्न RIPIT आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन RBP आरएनए: प्रोटीन परिसरों आरएनपी
आरएनए के पैरों के निशान की पहचान: TANDEM में आरएनए इम्यूनोएरिफ़िएसिस के माध्यम से प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अनुक्रमण द्वारा पीछा किया (RIPIT-सेक)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. … More

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq). J. Vis. Exp. (149), e59913, doi:10.3791/59913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter