Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.
Abstract
Die Signalisierung und Funktion einer Zelle wird durch die dynamischen Strukturen und Wechselwirkungen ihrer Oberflächenrezeptoren diktiert. Um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Rezeptoren vor Ort wirklich zu verstehen, müssen wir sie auf der Oberfläche der lebenden Zelle mit genügend raumzeitlicher Auflösung visualisieren und verfolgen. Hier zeigen wir, wie sie die kürzlich entwickelte Lattice Light-Sheet-Mikroskopie (LLSM) verwenden, um T-Zellrezeptoren (TCRs) vierdimensional (4D, Raum und Zeit) an der lebenden Zellmembran abzubilden. T-Zellen sind eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems, und hier haben wir T-Zellen als Beispiel verwendet, um zu zeigen, dass die Signalisierung und Funktion dieser Zellen durch die Dynamik und Wechselwirkungen der TCRs angetriebenwerden. LLSM ermöglicht 4D-Bildgebung mit beispielloser Raumzeitauflösung. Diese Mikroskopietechnik kann daher in der Biologie allgemein auf eine Vielzahl von Oberflächen- oder intrazellulären Molekülen verschiedener Zellen angewendet werden.
Introduction
Die genaue Dynamik des Molekülhandels und der Streuung auf der dreidimensionalen Zelloberfläche in Echtzeit war ein Rätsel, das es zu lösen gilt. Mikroskopie war schon immer ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung; Wenn ein oder zwei Maximierungen, wird die dritte minimiert. Aufgrund der geringen Größe und der immensen Geschwindigkeit, mit der sich Oberflächenrezeptoren bewegen, ist die Verfolgung ihrer Dynamik eine große technologische Herausforderung für den Bereich der Zellbiologie geblieben. Zum Beispiel wurden viele Studien mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie1,2,3durchgeführt, die eine hohe zeitliche Auflösung hat, aber nur ein sehr dünnes Stück der T-Zell-Membran (ca. 100 nm) abbilden kann und daher Ereignisse vermisst, die weiter entfernt in der Zelle geschehen. Diese TIRF-Bilder zeigen auch nur einen zweidimensionalen Abschnitt der Zelle. Im Gegensatz dazu können superhochauflösende Techniken wie die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM)4, die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)5und die stimulierte Emissionserschöpfungsmikroskopie (STED)6die Abbe-Beugungsgrenze des Lichts überwinden. Diese Techniken haben eine hohe räumliche Auflösung (20 nm Auflösung)4,5,6,7, aber sie dauern oft viele Minuten, um ein vollständiges zweidimensionales (2D) oder dreidimensionales (3D) Bild zu erhalten, und daher geht die zeitliche Auflösung verloren. Darüber hinaus können Techniken wie STORM und PALM, die auf blinkenden Signalen basieren, Ungenauigkeiten bei der Zählungvon 8,9haben. Elektronenmikroskopie hat bei weitem die höchste Auflösung (bis 50 pm Auflösung)10; es kann sogar dreidimensional mit fokussierter Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) durchgeführt werden, was zu bis zu 3 nm XY und 500 nm Z Auflösung11führt. Jede Form der Elektronenmikroskopie erfordert jedoch eine harte Probenvorbereitung und kann nur mit festen Zellen oder Geweben durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Bildgebung von Lebendenproben im Laufe der Zeit ausgeschlossen wird.
Techniken zur Erzielung der hohen raumzeitlichen Auflösung, die erforderlich ist, um die Dynamik von Oberflächen- und intrazellulären Molekülen in lebenden Zellen in ihrer wahren physiologischen 3D-Natur zu identifizieren, werden erst vor kurzem entwickelt. Eine dieser Techniken ist Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die eine strukturierte Lichtplatte verwendet, um photobleaching drastisch zu senken. Entwickelt im Jahr 2014 von Nobelpreisträger Eric Betzig, die hohe axiale Auflösung, geringe Photobleaching und Hintergrundgeräusche, und die Fähigkeit, gleichzeitig Hunderte von Ebenen pro Sichtfeld bilden LLS Mikroskope überlegen Widefield, TIRF und konfokale Mikroskope12,13,14,15,16,17,18,19. Diese vierdimensionale (x, y, z und zeit) Bildgebungstechnik, die zwar noch beugungsbegrenzt ist (200 nm XYZ-Auflösung), hat eine unglaubliche zeitliche Auflösung (wir haben eine Bildrate von etwa 100 fps erreicht, was zu einem 3D-rekonstruierten Zellbild mit 0,85 Sekunden pro Frame führt) für die 3D-Raumerfassung.
LLSM kann im Allgemeinen verwendet werden, um die Echtzeitdynamik von Molekülen innerhalb einer Zelle auf Einzelmolekül- und Einzelzellebene zu verfolgen, insbesondere in stark motilen Zellen wie Immunzellen. Zum Beispiel zeigen wir hier, wie man LLSM verwendet, um die T-Zell-Rezeptor-Dynamik (TCR) zu visualisieren. T-Zellen sind die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. TCRs sind verantwortlich für die Erkennung von Peptid-MHC (pMHC) Liganden, die auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC) angezeigt werden, die die Auswahl, Entwicklung, Differenzierung, Dasschicksal und Funktion einer T-Zelle bestimmen. Diese Erkennung tritt an der Schnittstelle zwischen T-Zellen und APCs auf, was zu lokalisierten Rezeptorclustern führt, um die so genannte immunologische Synapse zu bilden. Während bekannt ist, dass TCRs an der immunologischen Synapse für die T-Zell-Effektorfunktion unerlässlich sind, sind noch unbekannt die zugrunde liegenden Mechanismen des Echtzeit-TCR-Handels zur Synapse. LLSM hat es uns ermöglicht, die Dynamik von TCRs vor und nach dem Handel mit der resultierenden pMHC-TCR-Interaktion in Echtzeit zu visualisieren (Abbildung 1). LLSM kann daher verwendet werden, um aktuelle Fragen der prägenden Dynamik von TCRs zu lösen und Erkenntnisse zu liefern, um zu verstehen, wie eine Zelle zwischen selbst- und fremder Antigene unterscheidet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll wurde für die Verwendung von CD4+ T-Zellen optimiert, die von 5C isoliert wurden. C7-Transgenmäuse auf dem verwendeten LLSM-Instrument und daher andere Zellsysteme und LLSMs müssen möglicherweise unterschiedlich optimiert werden. Dieses Protokoll zeigt jedoch die Kraft der 4D-Bildgebung, da es verwendet werden kann, um die Dynamik eines Oberflächenrezeptors auf einer ganzen Zelle mit der geringsten Verzerrung unter physiologischen Bedingungen zu quantifizieren. Daher gibt es vie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Beratung und Anleitung von Dr. Vytas Bindokas von der University of Chicago würdigen. Wir danken der Integrated Light Microscopy Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung und Wartung des Gitter-Lichtbogenmikroskops. Diese Arbeit wurde durch den NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 und den NSF Career Award 1653782 (To J.H.) unterstützt. J.R. wird vom NSF Graduate Research Fellowships Program unterstützt.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
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