Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie
Summary
Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.
Abstract
De signalering en functie van een cel worden bepaald door de dynamische structuren en interacties van de oppervlaktereceptoren. Om de structuur-functie relatie van deze receptoren in situ echt te begrijpen, moeten we ze visualiseren en volgen op het levende celoppervlak met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier laten we zien hoe we recent ontwikkelde Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) kunnen gebruiken om T-celreceptoren (CDR’s) vierdimensionaal (4D, ruimte en tijd) te beelden in het levende celmembraan. T-cellen zijn een van de belangrijkste effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem, en hier gebruikten we T-cellen als voorbeeld om aan te tonen dat de signalering en functie van deze cellen worden aangedreven door de dynamiek en interacties van de CVR’s. LLSM zorgt voor 4D-beeldvorming met een ongekende spatiotemporale resolutie. Deze microscopietechniek kan daarom over het algemeen worden toegepast op een breed scala aan oppervlakte- of intracellulaire moleculen van verschillende cellen in de biologie.
Introduction
De precieze dynamiek van moleculen die in realtime op het driedimensionale celoppervlak worden verhandeld en verspreiden, is een raadsel om op te lossen. Microscopie is altijd een evenwicht geweest tussen snelheid, gevoeligheid en resolutie; als een of twee worden gemaximaliseerd, wordt de derde geminimaliseerd. Daarom, als gevolg van de kleine omvang en immense snelheid waarmee oppervlaktereceptoren bewegen, is het volgen van hun dynamiek een grote technologische uitdaging gebleven op het gebied van celbiologie. Bijvoorbeeld, veel studies zijn uitgevoerd met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie1,2,3, die een hoge temporele resolutie heeft, maar kan alleen beeld een zeer dun deel van de T-cel membraan (~ 100 nm), en mist daarom gebeurtenissen gebeurt verder weg in de cel. Deze TIRF-beelden tonen ook alleen een tweedimensionaal gedeelte van de cel. Super-resolutie technieken, zoals stochastische optische reconstructie microscopie (STORM)4, fotoactivated lokalisatie microscopie (PALM)5, en gestimuleerd emissie-uitputting microscopie (STED)6, kan overwinnen van de Abbe diffractie limiet van het licht. Deze technieken hebben een hoge ruimtelijke resolutie (~ 20 nm resolutie)4,5,6,7, maar ze nemen vaak vele minuten om een volledige twee-dimensionale (2D) of driedimensionaal (3D) beeld te verwerven, en dus de temporele resolutie verloren gaat. Bovendien kunnen technieken zoals STORM en PALM die afhankelijk zijn van knipperende signalen onnauwkeurigheden hebben bij het tellen van8,9. Elektronenmicroscopie heeft veruit de hoogste resolutie (tot 50 uur resolutie)10; het kan zelfs driedimensionaal worden uitgevoerd met gerichte ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM), wat resulteert in maximaal 3 nm XY en 500 nm Z resolutie11. Echter, elke vorm van elektronenmicroscopie vereist harde monstervoorbereiding en kan alleen worden uitgevoerd met vaste cellen of weefsels, waardoor de mogelijkheid van beeldvorming van levende monsters na verloop van tijd.
Technieken om de hoge spatiotemporale resolutie te verkrijgen die nodig zijn om de dynamiek van oppervlakte- en intracellulaire moleculen in levende cellen in hun ware fysiologische 3D-natuur te identificeren, worden pas onlangs ontwikkeld. Een van deze technieken is Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die gebruik maakt van een gestructureerd lichtvel om het bleken van foto’s drastisch te verlagen. Ontwikkeld in 2014 door Nobelprijswinnaar Eric Betzig, de hoge axiale resolutie, lage fotobleken en achtergrondgeluid, en het vermogen om tegelijkertijd beeld honderden vliegtuigen per gezichtsveld maken LLS microscopen superieur aan widefield, TIRF en confocale microscopen12,13,14,15,16,17,18,19. Deze vierdimensionale (x, y, z en tijd) imaging techniek, terwijl nog steeds diffractie beperkt (~ 200 nm XYZ resolutie), heeft een ongelooflijke temporele resolutie (we hebben een framerate van ongeveer 100 fps bereikt, wat resulteert in een 3D gereconstrueerdcelbeeld met 0,85 seconden per frame) voor 3D ruimtelijke acquisitie.
LLSM kan over het algemeen worden gebruikt om real-time dynamiek van elke moleculen in een cel op het eenmolecuul en eencellige niveau te volgen, met name die in zeer motile cellen zoals immuuncellen. We laten hier bijvoorbeeld zien hoe we LLSM kunnen gebruiken om t-cell receptor (TCR) dynamica te visualiseren. T-cellen zijn de effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem. CDR’s zijn verantwoordelijk voor de erkenning van peptide-MHC (pMHC) liganden weergegeven op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen (APC), die de selectie, ontwikkeling, differentiatie, lot en functie van een T-cel bepaalt. Deze herkenning vindt plaats op de interface tussen T-cellen en APC’s, wat resulteert in gelokaliseerde receptorclustering om de zogenaamde immunologische synaps te vormen. Hoewel het bekend is dat CVR’s bij de immunologische synaps noodzakelijk zijn voor t-cel effector functie, nog onbekend zijn de onderliggende mechanismen van real-time TCR-handel naar de synaps. LLSM heeft ons in staat gesteld om in real time de dynamiek van CVR’s voor en na de handel naar de synaps te visualiseren met de resulterende pMHC-TCR-interactie(figuur 1). LLSM kan daarom worden gebruikt om actuele vragen van de vormende dynamiek van CVR’s op te lossen en inzichten te verschaffen om te begrijpen hoe een cel onderscheid maakt tussen zelf- en vreemde antigenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van CD4+ T-cellen geïsoleerd van 5C. C7 transgene muizen op het gebruikte LLSM-instrument, en daarom moeten andere celsystemen en LLSM’s mogelijk anders worden geoptimaliseerd. Dit protocol toont echter de kracht van 4D-beeldvorming, omdat het kan worden gebruikt om de dynamiek van een oppervlaktereceptor op een hele cel te kwantificeren met de minste vervorming in fysiologische omstandigheden. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassing…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag het advies en de begeleiding van Dr Vytas Bindokas aan de Universiteit van Chicago erkennen. Wij danken de Integrated Light Microscopy Core Facility van de Universiteit van Chicago voor het ondersteunen en onderhouden van de rooster lichtplaatmicroscoop. Dit werk werd ondersteund door NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 en NSF Career Award 1653782 (Aan J.H.). J.R. wordt ondersteund door het NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
