Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi
Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man använder Lattice Light-Sheet Mikroskopi för att fyrdimensionellt visualisera ytreceptordynamik i levande celler. Här visas T-cellreceptorer på CD4+ primära T-celler.
Abstract
Signalering och funktion av en cell dikteras av de dynamiska strukturerna och interaktionerna hos dess ytreceptorer. För att verkligen förstå struktur-funktion förhållandet mellan dessa receptorer på plats, måste vi visualisera och spåra dem på levande cellytan med tillräckligt spatiotemporal upplösning. Här visar vi hur man använder nyligen utvecklade Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) för att avbilda T-cellsreceptorer (TCRs) fyrdimensionellt (4D, utrymme och tid) vid levande cellmembranet. T-celler är en av de viktigaste effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet, och här använde vi T-celler som ett exempel för att visa att signalering och funktion av dessa celler drivs av dynamiken och interaktionerna hosTAT. LLSM möjliggör 4D-avbildning med oöverträffad spatiotemporal upplösning. Denna mikroskopiteknik kan därför i allmänhet appliceras på ett brett spektrum av yt- eller intracellulära molekyler av olika celler i biologin.
Introduction
Den exakta dynamiken i molekyler som handlar och sprider sig på den tredimensionella cellytan i realtid har varit en gåta att lösa. Mikroskopi har alltid varit en balans mellan hastighet, känslighet och upplösning; Om någon eller två maximeras minimeras den tredje. Därför, på grund av den lilla storleken och enorma hastighet med vilken ytan receptorer flytta, spåra deras dynamik har förblivit en stor teknisk utmaning för området cellbiologi. Till exempel har många studier genomförts med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har hög tidsmässig upplösning, men kan bara bild en mycket tunn del av T-cell membranet (~ 100 nm), och därför missar händelser som händer längre bort i cellen. Dessa TIRF-bilder visar också bara en tvådimensionell del av cellen. Däremot super-upplösning tekniker, såsom stokastiska optisk akonstruktion mikroskopi (STORM)4, fotoaktiverat lokalisering mikroskopi (PALM)5, och stimuleras utsläpp utarmning mikroskopi (STED)6, kan övervinna Abbe diffraktion gränsen för ljus. Dessa tekniker har hög rumslig upplösning (~ 20 nm upplösning)4,5,6,7, men de tar ofta många minuter att förvärva en fullständig tvådimensionell (2D) eller tredimensionell (3D) bild, och därför den tidsmässiga upplösningen går förlorad. Dessutom kan tekniker som STORM och PALM som är beroende av blinkande signaler ha felaktigheter i att räkna8,9. Elektronmikroskopi har den överlägset högsta upplösningen (upp till 50 upplösning)10; det kan även genomföras tredimensionellt med fokuserad jonstråle scanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), vilket resulterar i upp till 3 nm XY och 500 nm Z upplösning11. Emellertid, någon form av elektronmikroskopi kräver hårda provberedning och kan endast utföras med fasta celler eller vävnader, vilket eliminerar möjligheten att avbildning levande prover över tiden.
Tekniker för att få den höga spatiotemporal upplösning som krävs för att identifiera dynamiken i ytan och intracellulära molekyler i levande celler i deras sanna fysiologiska 3D-natur är först nyligen utvecklas. En av dessa tekniker är Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som använder en strukturerad ljusark för att drastiskt lägre photobleaching. Utvecklad 2014 av Nobelpristagaren Eric Betzig, den höga axiella upplösningen, låg photobleaching och bakgrundsljud, och förmåga att samtidigt bild hundratals plan per synfält gör LLS mikroskop överlägsen widefield, TIRF och konfokala mikroskop12,13,14,15,16,17,18,19. Denna fyrdimensionella (x, y, z och tid) bildteknik, medan fortfarande diffraktion begränsad (~ 200 nm XYZ upplösning), har otrolig tidsupplösning (vi har uppnått en bildhastighet på ca 100 fps, vilket resulterar i en 3D rekonstruerad cellbild med 0,85 sekunder per bild) för 3D spatial förvärv.
LLSM kan i allmänhet användas för att spåra realtidsdynamiken hos alla molekyler inom någon cell på enmolekyl- och encellnivå, särskilt de i mycket rörliga celler som immunceller. Till exempel visar vi här hur du använder LLSM för att visualisera T-cellsreceptordynamik (TCR). T-celler är effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet. TCRs ansvarar för att känna igen peptid-MHC (pMHC) ligands visas på ytan av antigen-presenteraceller (APC), som bestämmer urval, utveckling, differentiering, öde och funktion av en T-cell. Detta erkännande sker vid gränssnittet mellan T-celler och APC, vilket resulterar i lokaliserade receptorkludering för att bilda vad som kallas immunologisk synaps. Även om det är känt att TCRs vid immunologiska synaps är absolut nödvändigt för T-cells effector funktion, fortfarande okänd är de underliggande mekanismerna för realtid TCR människohandel till synapsen. LLSM har gjort det möjligt för oss att i realtid visualisera dynamiken i TCRs före och efter människohandel till synapsen med den resulterande pMHC-TCR interaktion (figur 1). LLSM kan därför användas för att lösa aktuella frågor om tcr-formatdynamiken och ge insikter för att förstå hur en cell skiljer mellan själv- och utländska antigener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet optimerades för användning av CD4+ T-celler isolerade från 5C. C7 transgena möss på LLSM-instrumentet som används, och därför kan andra cellsystem och LLSMs behöva optimeras på olika sätt. Detta protokoll visar dock kraften i 4D-avbildning, eftersom det kan användas för att kvantifiera dynamiken i en ytreceptor på en hel cell med minst distorsion i fysiologiska förhållanden. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar av denna teknik.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill erkänna råd och vägledning från Dr Vytas Bindokas vid University of Chicago. Vi tackar Integrated Light Microscopy Core Facility vid University of Chicago för att stödja och underhålla galler ljusplåtmikroskop. Detta arbete stöddes av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 och NSF Career Award 1653782 (till J.H.). Jr stöds av NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
