Este protocolo describe una configuración original que combina mediciones de vida útil espectral y fluorescencia para evaluar la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) entre las sondas fluorescentes a base de rodamina y el polímero de lignina directamente en secciones gruesas de la planta.
En la biomasa lignocelulósica (LB), la actividad de las enzimas está limitada por la aparición de interacciones no específicas con lignina durante el proceso de hidrólisis, que mantiene las enzimas lejos de su sustrato. La caracterización de estas interacciones complejas es por lo tanto un desafío en sustratos complejos como LB. El método aquí mide las interacciones moleculares entre las moléculas etiquetadas con fluoróforo y la lignina autofluorescente nativa, que serán reveladas por la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET). Contrariamente a las mediciones de FRET en células vivas que utilizan dos fluoróforos exógenos, las mediciones de FRET en plantas que utilizan lignina no son triviales debido a su compleja autofluorescencia. Hemos desarrollado una tubería de adquisición y análisis original con la observación correlacionada de dos propiedades complementarias de la fluorescencia: emisión de fluorescencia y vida útil. sFLIM (microscopía de imágenes de por vida espectral y fluorescente) proporciona la cuantificación de estas interacciones con alta sensibilidad, revelando diferentes niveles de interacción entre biomoléculas y lignina.
La hidrolcelulosa hidrolizante en azúcares monoméricos como la glucosa requiere enzimas. Su actividad es conocida por ser restringida por el establecimiento de interacciones no específicas entre enzimas y lignina1,2, siendo este último un polímero hidrófobo y un componente importante de lignocelulosa3. Por lo tanto, medir cuantitativamente estas interacciones directamente a escala celular es un desafío que debe abordarse para optimizar la actividad catalítica enzimática y el pretratamiento de lignocelulosa4.
La medición de la transferencia de energía por resonancia (FRET) es un método de elección para asses biomoléculas de interacción in situ. Esta transferencia de energía no radiativa puede ocurrir entre un donante y un fluoróforo aceptador si cumplen condiciones diferentes. El espectro de emisión de donantes debe superponerse, al menos parcialmente, al espectro de excitación de los aceptadores. Por lo tanto, la elección de fluoróforos es crucial para tales experimentos. Entonces, la eficiencia de transferencia disminuye con la sexta potencia de su distancia5 y sólo ocurre si ambas moléculas están cerca (típicamente en el rango de nanómetros). Otra contingencia puede alterar la eficiencia de transferencia, como la orientación dipolo-dipolo, pero se mitigan si los fluoróforos tienen flexibilidad.
FRET se puede medir por diferentes técnicas y descripciones detalladas se pueden encontrar en la literatura6,7. En resumen, los principales métodos se basan en: i) emisiones sensificadas en las que se sigue la variación en la fluorescencia de emisión de aceptación y proporciona resultados principalmente cualitativos; ii) fotoblanqueo del aceptador en el que se mide la fluorescencia de emisión del donante antes y después del fotoblanqueo del aceptador (en este caso, se pueden lograr estimaciones más precisas de FRET, pero requieren una fuerte potencia láser aplicada a las muestras fijas); y iii) medición de por vida que disminuye para el donante en presencia del aceptador. Este método requiere instrumentos específicos y permite mediciones de interacción precisas y sensibles entre fluoróforos. Teniendo en cuenta la medición de FRET entre las sondas fluorescentes y la lignocelulosa, la principal dificultad es que la lignocelulosa no es un solo fluoróforo bien caracterizado: tiene una fuerte autofluorescencia nativa y espectralmente amplia, principalmente originada a partir de lignina, y dependiente de la especiedebiomasa8,9.
En este documento, proponemos un procedimiento nuevo y original adaptado a secciones de muestras de madera/planta. Este método basado en sFLIM abre el camino a mediciones cuantitativas de FRET entre sondas fluorescentes y lignina en muestras nativas de lignocelulosa.
La correlación de la vida útil de la fluorescencia y las mediciones del espectro de emisiones permiten combinar las ventajas de ambos métodos. De hecho, las mediciones espectrales por sí solas carecen de sensibilidad y siguen siendo cualitativas. Por otro lado, la vida útil de la fluorescencia es el método de elección para las mediciones cuantitativas tradicionales de FRET, pero se demostró que la autofluorescencia de lignina podría variar dependiendo de la composición de la lignina y el entorno16. Por lo tanto, las interacciones de lignina con un aceptador o cambios estructurales de lignina no pueden ser discriminadas ya que ambas resultan en una disminución de por vida. Como se ha demostrado, el método desarrollado proporciona una medición inequívoca, sensible y cuantitativa de las interacciones entre la lignina y las moléculas de los aceptadores en las secciones de las plantas. Incluso si los diferentes pasos del método se optimizaron rigurosamente, se debe tener especial cuidado con los siguientes puntos.
En cuanto a las muestras, la calidad de la sección de la planta es fundamental para garantizar imágenes enfocadas. Los diferentes pasos para la incrustación de PEG deben seguirse estrictamente. El paso final de lavado es esencial para garantizar que no quede interferencia de PEG en las muestras. Además, la concentración de tampón y el pH deben mantenerse estrictamente idénticos para todas las mediciones, ya que cualquier cambio puede tener un fuerte impacto en las propiedades de fluorescencia.
La medición de por vida también puede ser delicada. La vida útil de la fluorescencia del donante puede ser inestable, por ejemplo debido a una alta excitación. En tal caso, ajustar la potencia del láser y el zoom puede solucionar el problema. Otra fuente bien conocida de artefactos en las mediciones de TCSPC es la acumulación de pulsos de fotones. De hecho, TCSPC no puede medir la velocidad de dos fotones emitidos entre los mismos dos pulsos láser. Mientras que las muestras de plantas están altamente estructuradas, la fluorescencia no es homogénea y puede conducir a un efecto de acumulación de pulso oculto. Mientras que el número de fotones por segundo permanece por debajo del límite de excitación del 1%, puede ser mayor en algunas áreas de muestra. Para garantizar que no haya experimentos de acumulación, se puede considerar la medición de la vida útil de la fluorescencia del donante en un flujo de fotones diferente. Si la vida útil aumenta mientras el flujo disminuye, un efecto de acumulación está alterando las mediciones. El flujo de fotón óptimo se alcanza con la estabilidad de por vida del donante.
En cuanto al análisis de curva de descomposición sFLIM, se recomienda confiar en cada ajuste de curva individual para asegurarse de que el modelo describe con precisión las mediciones. Si no es el caso, primero asegúrese de que ninguno de los artefactos mencionados anteriormente ha dañado los datos. A continuación, el paso 2.1.4 proporciona la función de respuesta instrumental (IRF) del sistema. Si el IRF presenta algunas anomalías, optimice la trayectoria óptica para minimizarlas. También se puede utilizar un IRF medido para el montaje durante el paso 6.2. Por último, los grados de libertad del modelo de ajuste se pueden aumentar a una decadencia triexponencial en el paso 6.2. Sin embargo, el número de fotones necesarios para la determinación individual de la vida útil y la proporción es alto y, por lo tanto, se recomienda usarlos solo para lograr una vida media más estable a partir del paso 6.4. Información más exhaustiva sobre FLIM, su caracterización18,sFLIM y su aplicación12 notablemente a lignin10, se puede encontrar en la literatura.
Aunque es difícil, la medición de FRET en tejidos vegetales utilizando autofluorescencia nativa muestra algunas ventajas. En comparación con las mediciones FRET realizadas en tejidos vivos en los que los estudios de interacción entre biomoléculas a menudo requieren ingeniería genética para expresar marcadores fluorescentes intrínsecos, los tejidos vegetales inflamados como los presentados aquí, ofrecen autofluorescencia, y las sondas fluorescentes de pareja extrínsicas se pueden agregar fácilmente, ahorrando mucho tiempo. Sin embargo, dependiendo de las especies vegetales analizadas y de los posibles pretratamientos realizados, es probable que se modifique la autofluorescencia, por lo que es necesario caracterizarla cuidadosamente y que el fluoróforo utilizado como sondas pueda necesitar ser adaptado.
El método sFLIM debe aplicarse a sondas fluorescentes que carezcan de actividad catalítica (PEG y dextran). En el marco de la hidrólisis de lignocelulosa vegetal, se podrían realizar interacciones de enzimas en diversas muestras de biomasa, lo que posiblemente resultaría en la determinación del impacto de la localización (células y tejidos) en la fuerza de interacción. El siguiente paso de optimización será la automatización del paso de análisis. De hecho, con suficientes datos analizados, se podría implementar un procedimiento de análisis basado en el aprendizaje automático para el análisis automatizado de fenotipos, lo que aumentaría su amenabilidad a un rápido cribado de eficiencia enzimática-biomasa. Además, sFLIM no requiere fijación de la muestra y se puede aplicar fácilmente a estudios dinámicos de interacción enzima-lignina. Tal método único es probable que guíe la estrategia de ingeniería enzimática y el pretratamiento de la biomasa para optimizar la valorización de la lignocelulosa.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) es calurosamente agradecida por la preparación de las cifras. La Federación de Investigación FRABio (Universidad de Lille, CNRS) es reconocida por proporcionar el entorno técnico propicio para lograr este trabajo. Se obtuvo financiación de la Agencia Nacional de Investigación francesa (proyecto LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |