Detta protokoll beskriver en ursprunglig inställning som kombinerar spektral-och fluorescenslivstids mätningar för att utvärdera Förster resonans energiöverföring (FRET) mellan rhodamine-baserade fluorescerande sonder och lignin polymer direkt i tjocka Plant sektioner.
I lignocellulosa biomassa (lb), aktiviteten av enzymer begränsas av uppkomsten av icke-specifika interaktioner med lignin under hydrolys processen, som upprätthåller enzymer långt från deras substrat. Karakterisering av dessa komplexa interaktioner är därför en utmaning i komplexa substrat såsom LB. Metoden här mäter molekylära interaktioner mellan fluorophore-märkta molekyler och infödda autofluorescent lignin, som ska avslöjas av Förster resonans Energy Transfer (FRET). I motsats till FRET mätningar i levande celler med hjälp av två exogena fluoroforer, FRET mätningar i växter som använder lignin är inte trivialt på grund av dess komplexa autofluorescence. Vi har utvecklat en ursprunglig förvärvs-och analyspipeline med korrelerad observation av två kompletterande egenskaper för fluorescens: fluorescensutsläpp och livslängd. sFLIM (Spectral och fluorescerande livstid Imaging Microscopy) ger kvantifiering av dessa interaktioner med hög känslighet, avslöjar olika interaktions nivåer mellan biomolekyler och lignin.
Hydrolyzing lignocellulosa till monomersocker såsom glukos kräver enzymer. Deras verksamhet är känd för att hindras av inrättandet av icke-specifika interaktioner mellan enzymer och lignin1,2, densenare är en hydrofob polymer och en viktig beståndsdel i lignocellulosa3. Sålunda, kvantitativt mäta sådana interaktioner direkt på cell skalan är en utmaning som måste åtgärdas för att optimera enzym katalytisk aktivitet och lignocellulosa förbehandling4.
Förster (eller Fluorescence) resonans energiöverföring (FRET) mätning är en metod för att välja att åsnor biomolekyler interaktion in situ. Denna icke strålningsenergi överföring kan uppstå mellan en givare och en acceptor fluorophore om de uppfyller olika villkor. Givar spektrumet för utsläpp måste, åtminstone delvis, överlappa det acceptorer som är magnetiseringen. Valet av fluoroforer är således avgörande för sådana experiment. Därefter minskar överföringen effektivitet med den sjätte kraften av deras avstånd5 och endast uppstår om båda molekylerna är i nära närhet (typiskt i nanometer Range). Andra oförutsedda händelser kan förändra överföringen effektivitet såsom dipole-dipole orientering men mildras om fluoroforer har flexibilitet.
FRET kan mätas med olika tekniker och detaljerade beskrivningar finns i litteraturen6,7. I korthet förlitar sig de huvudsakliga metoderna på: i) sensibiliserade utsläpp där variationen i acceptorns emissions fluorescens följs och ger huvudsakligen kvalitativa resultat. II) acceptor photoblekning där givaren emissions fluorescens mäts före och efter acceptor photoblekning (i detta fall, mer exakt FRET uppskattningar kan uppnås men kräver stark lasereffekt tillämpas på fasta prover); och III) livstids mätning som minskar för givaren i närvaro av acceptorn. Denna metod kräver specifika instrument och möjliggör precisa och känsliga interaktions mätningar mellan fluoroforer. Med tanke på bandet mätning mellan fluorescerande sonder och lignocellulosa, är den största svårigheten att lignocellulosa är inte en enda väl kännetecknas fluorophore: den har en stark infödda och spektralt hela autofluorescence, främst från lignin, och beroende av biomassa arter8,9.
I detta dokument föreslår vi ett nytt och originellt förfarande anpassat till delar av trä-/växtprover. Denna sFLIM baserad metod öppnar vägen till kvantitativa FRET mätningar mellan fluorescerande sonder och lignin i inhemska lignocellulosa prover.
Korrelering av fluorescenslivstiden och mätningar av utsläpps spektrum gör det möjligt att kombinera fördelar med båda metoderna. Faktum är att spektralmätningar enbart saknar känslighet och förblir kvalitativa. Å andra sidan, fluorescens livstid är den metod för val för traditionella kvantitativa FRET mätningar, men det visades att lignin autofluorescence kan variera beroende på lignin sammansättning och miljö16. Således kan lignin interaktioner med en acceptor eller lignin strukturella förändringar inte diskrimineras eftersom de båda resulterar i en livstid minskning. Som visats ger den utvecklade metoden entydig, känslig och kvantitativ mätning av interaktioner mellan lignin-och acceptormolekyler i växt sektioner. Även om de olika stegen i metoden rigoröst optimerats, måste försiktighet iakttas särskilt för följande punkter.
När det gäller proverna är kvaliteten på anläggningen avsnitt avgörande för att säkerställa i-fokus avbildning. De olika stegen för PEG inbäddning bör strikt följas. Det slutliga tvättsteget är viktigt för att säkerställa att inga störningar från PEG kvar i proverna. Dessutom bör buffertkoncentrationen och pH-värdet hållas strikt identiska för alla mätningar, eftersom alla förändringar kan ha en stark inverkan på fluorescensegenskaper.
Livstids mätning kan också vara delikat. Fluorescensens livstid för givaren kan vara instabil, till exempel på grund av en hög excitation. I ett sådant fall, tuning lasern makt och zoom kan åtgärda problemet. En annan välkänd källa till artefakter i TCSPC mätningar är Photon Pulse Pile-up. I själva verket kan TCSPC inte mäta hastigheten på två fotoner som avges mellan samma två laserpulser. Medan växtprover är mycket strukturerade, fluorescens är inte homogen och kan leda till en dold puls pileup effekt. Medan antalet fotoner per sekund förblir under 1% excitation gränsen, det kan vara högre i vissa provområden. För att säkerställa inga pileup experiment, mäta givarens fluorescens livslängd vid en annan Photon Flux kan övervägas. Om livslängden ökar medan flödet minskar, ändrar en pileup-effektmätningar. Optimal Photon Flux uppnås med givarens livstid stabilitet.
När det gäller sFLIM Decay kurva analys, rekommenderar vi att förlita sig på varje individuell kurva passar för att säkerställa att modellen korrekt beskriver mätningar. Om så inte är fallet, se först till att ingen av de tidigare nämnda artefakterna har skadat data. Steg 2.1.4 ger sedan den instrumentella responsfunktionen (IRF) i systemet. Om IRF presenterar vissa avvikelser, optimera den optiska vägen för att minimera dem. En uppmätt IRF för montering under steg 6,2 kan också användas. Slutligen kan montering modellens frihetsgrader ökas till en tre-exponentiell sönderfall i steg 6,2. Emellertid, antalet fotoner som krävs för individuell livstid och andel bestämning är hög och det är därför rekommenderas endast använda dem för att uppnå en stabilare medellivstid från steg 6,4. Mer uttömmande information om FLIM, dess karakterisering18, sflim och dess tillämpning12 särskilt lignin10, finns i litteraturen.
Även utmanande, FRET mätning i växt vävnader med infödda autofluorescence visar några fördelar. I jämförelse med FRET mätningar som utförs på levande vävnader där interaktionsstudier mellan biomolekyler ofta kräver genteknik för att uttrycka inneboende fluorescerande markörer, lignifierade växt vävnader som de som presenteras här, erbjuder naturliga autofluorescence, och extrinsic partner fluorescerande sonder kan enkelt läggas, spara mycket tid. Emellertid, beroende på den analyserade växtarter och på eventuella pre-behandlingar som utförs, autofluorescence kommer sannolikt att ändras, så att den måste noggrant kännetecknas och fluorophore används som sonder kan behöva anpassas.
SFLIM-metoden måste appliceras på fluorescerande prober som saknar katalytisk aktivitet (PEG och dextran). Inom ramen för växtlignocellulosa hydrolys, interaktioner av enzymer i olika biomassa prover kan utföras, möjligen resulterar i bestämning av effekterna av lokalisering (celler och vävnader) på interaktions styrka. Nästa optimerings steg kommer att vara automatisering av analys steget. Med tillräckligt analyserade data skulle en maskininlärningsbaserad ANALYSPROCEDUR kunna användas för automatiserad fenotyp analys, vilket skulle öka dess mottaglighet för snabb screening för effektiv enzym biomassa. Dessutom kräver sFLIM inte fixering av provet och kan enkelt appliceras på dynamiska enzym-lignin interaktionsstudier. En sådan unik metod är sannolikt att vägleda enzym Engineering strategi och biomassa förbehandling för att optimera lignocellulosa valorization.
The authors have nothing to disclose.
Fanny Laurent (FARE) är varmt tackade för utarbetandet av siffrorna. Forsknings federationen FRABio (universitetet i Lille, CNRS) erkänns för att tillhandahålla den tekniska miljö som bidrar till att uppnå detta arbete. Finansiering erhölls från Frankrikes nationella forsknings byrå (LIGNOPROG-projektet ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |